Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Повреждение клеточной ДНК активными формами кислорода служит источником мутаций и генетической нестабильности. При окислительном стрессе возникают десятки различных окисленных модификаций оснований ДНК. К наиболее распространенным повреждениям относятся 7,8-дигидро-8-оксо-2'-дезоксигуанозин (8-oxo-dG) и 7,8-дигидро-8-оксо-2'-дезоксиаденозин (8-oxo-dА). 8-oxo-dA образуется всего в 3 раза реже, чем 8-oxo-dG. 8-oxo-dA также обладает значительным мутагенным потенциалом в клетках млекопитающих, индуцируя A>G транзиции и A>C трансверсии (мутационная «горячая точка» в HRAS онкогене). Однако репликация ДНК с 8-oxo-dA не изучена. Имеются лишь отрывочные сведения о точности и эффективности синтеза трех из пятнадцати ДНК-полимераз человека на ДНК с 8-oxo-dA. В ходе второго года реализации проекта был впервые проведен сиcтематический анализ влияния сиквенс-контекста на активность ДНК-полимераз человека семейств Y (Pol iota, Pol eta, Pol kappa, REV1), Х (Pol kappa, Pol beta) и В (Pol zeta), а также праймазы-полимеразы PrimPol напротив 8-oxo-dA in vitro в реакциях с олигонуклеотидными ДНК-субстратами, содержащими 8-oxo-dA. Было показано, что ДНК-полимеразы семейства Y в наибольшей степени чувствительны к нуклеотидному окружению повреждения. Замена нуклеотида в +2 положении, прилежащем к 8-oxo-dA, оказала существенное влияние как на эффективность, так и точность транслезионного синтеза Pol eta, Pol kappa, Pol iota и REV1 человека. Чувствительность Y-ДНК-полимераз к сиквенс-контексту может объясняться наличием уникального домена little finger, образующего дополнительные контакты с матричной ДНК. Установлено, что сиквенс-контекст влияет на точность копирования ДНК напротив 8-oxo-dA PrimPol в реакциях с Mn2+, но не с Mg2+, что связано с образованием микроделеций при реализации механизма «сминания матрицы». Проанализировано влияние регуляторных репликативных факторов на транслезионную активность активность ДНК-полимераз напротив 8-oxoA. Показано, что PCNA и RPA в незначительной степени стимулируют транслезионную активность ДНК-полимераз семейства Y напротив 8-oxoA, не оказывая заметного влияния на точность копирования 8-oxoA. RPA, но не PCNA стимулирует транслезионную активность PrimPol на ДНК с 8-oxoA. В качестве подготовительного тапа для проведения исследований в 2025 году был получен и очищен 8-oxo-dATP. Полученные результаты вносят вклад в понимание механизмов промутагенной репликации ДНК с 8-oxo-dA или защите клеток от мутагенеза, ассоциированного с 8-oxo-dA.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Повреждение клеточной ДНК активными формами кислорода служит источником мутаций и генетической нестабильности. При окислительном стрессе возникают десятки различных окисленных модификаций оснований ДНК. К наиболее распространенным повреждениям относятся 7,8-дигидро-8-оксо-2'-дезоксигуанозин (8-oxo-dG) и 7,8-дигидро-8-оксо-2'-дезоксиаденозин (8-oxo-dА). 8-oxo-dA образуется всего в 3 раза реже, чем 8-oxo-dG. 8-oxo-dA также обладает значительным мутагенным потенциалом в клетках млекопитающих, индуцируя A>G транзиции и A>C трансверсии (мутационная «горячая точка» в HRAS онкогене). Однако репликация ДНК с 8-oxo-dA не изучена. Имеются лишь отрывочные сведения о точности и эффективности синтеза трех из пятнадцати ДНК-полимераз человека на ДНК с 8-oxo-dA. Не изучено и включение окисленной формы 8-oxodATP ДНК-полимеразами из пула нуклеотидов. В 2005 году с помощью молекулярного докинга был проведен анализ механизмов ингибирования Pol iota напротив 8-oxoA и высокой, но промутагенной активности Pol eta напротив 8-oxoA. Были проведены дополнительные (незапланированные при подаче заявки) исследования по получению продуцентов и выделению каталитических субъединиц репликативных ДНК-полимераз человека Pol epsilon и Pol delta. С полученным препаратом Pol epsilon были проведены исследования по включению 8-oxodATP. Важнейшей задачей третьего года реализации проекта стало первое в мире сиcтематическое исследование включения 8-oxodATP шестью ДНК-полимеразами разных семейств: Y (Pol iota, Pol eta, Pol kappa, REV1), Х (Pol kappa, Pol beta) и В (Pol epsilon). Показано, что ДНК-полимеразы человека значительно отличаются по способности к включению 8-oxodATP. Среди протестированных ферментов Pol lambda показала наименьшую способность дискриминировать 8-oxo-dATP напротив матричного Т как на одноцепочечных, так и на двухцепочечных ДНК-субстратах с 1-нт брешью. Pol beta была достаточно точна на одноцепочечных ДНК-субстратах, но эффективно включала 8-oxo-dATP напротив Т на двуцепочечном ДНК-субстрате с 1-нт брещью. Достаточно неожиданным результатом стало то, что каталитическая субъединица высокоточной Pol epsilon включала 8-oxo-dATP напротив Т и G со слабой, но более высокой эффективностью по сравнению с транслезионными полимеразами семейства Y. Хотя структуры человеческих полимераз с входящим 8-oxo-dATP в настоящий момент не расшифрованы, для каждой из ДНК-полимераз мы предположили возможный механизм включения/дискриминации 8-oxo-dATP. Полученные результаты вносят вклад в понимание механизмов промутагенной репликации ДНК с 8-oxo-dATP или защите клеток от мутагенеза, ассоциированного с 8-oxo-dA. По результатам проекта в 2025 году опубликована статья по активности PrimPol на ДНК с 8-oxoA в журнале Int J Mol Sci (Q1) и статья по включению 8-oxodATP находится на рецензии в журнале Int J Mol Sci (Q1). По результатам проекта также подготовлена кандидатская диссертация Кручинина Александра «Транслезионная активность ДНК-полимераз человека на ДНК с повреждениями 8-оксогуанин и 8-оксоаденин». Предзащита состоялась 25.09.2025 в НИЦ Курчатовский институт.