Широкомасштабный поиск малых открытых рамок считывания, необходимых для пролиферации клеток человека

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-14-00058

НазваниеШирокомасштабный поиск малых открытых рамок считывания, необходимых для пролиферации клеток человека

Руководитель Рубцова Мария Петровна, Доктор химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова» , г Москва

Конкурс №80 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые слова трансляция, регуляция, открытая рамка считывания, малая открытая рамка считывания, пролиферация, скрининг

Код ГРНТИ34.15.25

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Развитие методов анализа экспрессии генов позволило обнаружить явление повсеместной транскрипции и трансляции генетической информации. Роль трансляции малых открытых рамок считывания в настоящее время недостаточно изучена. Настоящий проект направлен на широкомасштабный поиск малых открытых рамок считывания, участвующих в пролиферации клеток человека. Трансляция малой открытой рамки считывания может приводить к синтезу пептида, играющего регуляторную роль в определенном процессе, или быть регуляторным событием в отношении трансляции основной открытой рамки считывания, что позволяет клетке быстро реагировать на изменившиеся условия. Факт повсеместной трансляции в настоящее время установлен, но работ, посвященных систематическому изучению малых открытых рамок считывания и их роли в регуляции определенных процессов в клетке, практически нет. В настоящем проекте мы планируем провести широкомасштабный поиск малых открытых рамок считывания, участвующих в пролиферации клеток человека. Разработанную в ходе выполнения проекта, методологию можно будет в дальнейшем использовать для выявления малых открытых рамок считывания, участвующих в регуляции других внутриклеточных процессов.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Шепелев Н.М., Курочкина А.О., Донцова О.А., Рубцова М.П. PRPF19 кодирует малую открытую рамку считывания, которая важна для жизнеспособности клеток человека Наука, V.515, p.41-47 (год публикации - 2024)
10.1134/S1607672923700722

2. Шамонова М.А., Корягина М.С., Шляпина В.Л., Донцова О.А., Рубцова М.П. Protein Complementation Approach for Quantitative and Qualitative Analysis of hTERP in Cell Доклады Академии Наук. Науки о жизни, V.523, p.452-457 (год публикации - 2025)
10.1134/S1607672925600514

3. Разумова Е.А., Макарюк А., Донцова О.А., Шепелев Н.М., Рубцова М.П. Structural Features of 5′ Untranslated Region in Translational Control of Eukaryotes MDPI, 26(5), 1979 (год публикации - 2025)
10.3390/ijms26051979

4. Буренина О.Ю., Макарченко Р.К., Рубцова М.П., Донцова О.А. Liver-specific lncRNAs associated with liver cancers FEBS Open Bio, 1383–1405 (год публикации - 2025)
10.1002/2211-5463.70079

5. Лавров А.И., Шепелев Н.М., Донцова О.А., Рубцова М.П. Methodological Toolbox for Identifying and Studying Micropeptides: From Genome to Function Biochemistry (Moscow), V.90, №11, p.1521-1535 (год публикации - 2025)
10.1134/S0006297925602242

6. Камзеева П., Шепелев Н., Заббарова В., Брылев В., Чистов А., Рязанцев Д., Кот Э., Новопашина Д., Рубцова М., Аралов А. Structural Characterization of DDX23 5′ UTR Regulatory Elements and Their Targeting by LNA-Modified Antisense Oligonucleotides IJMS, 26, 11047 (год публикации - 2025)
10.3390/ijms262211047

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В ходе второго года выполнения проекта проведен анализ данных скрининга малых ОРС, которые важны для пролиферации клеток человека. Обнаружено, что инактивация 135 малых ОРС снижает жизнеспособность клеток модельной линии HAP1. Индивидуальная проверка 25 малых ОРС при помощи анализа конкуренции показала, что случайные мутации в 22 малых ОРС отрицательно влияют на пролиферацию мутантных клеток по сравнению с диким типом. Проведено клонирование последовательности и анализ 5’-концов мРНК для 6 проверенных малых ОРС методом 5’ RACE, который подтвердил последовательность 5’-концов целевых транскриптов. С помощью клонированных последовательностей подтверждена трансляция 4 малых ОРС в составе репортерной конструкции при помощи мечения кодируемых пептидов меткой HiBiT. Кроме того, для 2 малых ОРС получены клеточные линии со вставкой последовательности довеска HiBiT на С-конце кодируемых ими пептидов. При помощи данных линий показано, что кодируемые меченые пептиды присутствуют в клетках при эндогенной экспрессии. Для изучения функции конкретной малой ОРС получены клеточные линии с инактивированной малой ОРС гена MCRS1 с помощью системы CRISPR-Cas9. Установлено, что данная малая ОРС подавляет трансляцию основной ОРС MCRS1. Кроме того, показано, что в 5’-нетранслируемой области гена MCRS1 также присутствует несколько других малых ОРС, которые принципиально могут транслироваться.

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В ходе третьего года выполнения проекта проведен с скрининг малых ОРС на клеточных линиях A549 и HEK293T, которые важны для пролиферации клеток человека. Обнаружено, что инактивация 31 и 23 малых ОРС снижает пролиферацию клеток модельных линий A549 и HEK293T, соответственно. При сравнении результатов, полученных на линиях HAP1, A549 и HEK293T, установлено, что большая часть малых ОРС является специфически важной для пролиферации только одной или двух линий клеток. Для разграничения отобранных мишеней на регуляторные и кодирующие функциональный пептид мы провели ряд экспериментов. Во-первых, мы оценили влияние мутаций в кодирующей последовательности на пролиферацию клеток в шести генах и провели сравнение этого влияния с аналогичными эффектами для малых ОРС этих генов. Результаты для двух генов позволяют предположить независимую, важную для пролиферации HAP1, функцию пептидов малых ОРС этих генов. Во-вторых, мы провели инактивацию при одновременной комплементации кодируемого пептида малых ОРС двух генов. Результаты комплементации указывают на отсутствие независимой функции пептидов данных малых ОРС для пролиферации клеток линии HAP1. В-третьих, для трех малых ОРС получены образцы геномной ДНК для анализа мутаций, индуцируемых двухцепочечных разрывом из-за действия CRISPR–Cas9, по их влиянию на пролиферацию клеток при помощи высокопроизводительного секвенирования, чтобы оценить вклад конкретных мутаций в снижение пролиферации клеток линии HAP1. Помимо общего анализа мишеней мы провели эксперименты для выяснения роли малой ОРС гена MCRS1. В рамках этого мы получили и протестировали люциферазные репортеры для определения механизма регуляции трансляции кодирующей последовательности за счет малой ОРС MCRS1. Нами установлено, что мутации с различным укорочением малой ОРС снижают ее репрессивное влияние на трансляцию кодирующей последовательности. В то же время слияние малой ОРС с основной ОРС не повышает уровень функционального белкового продукта кодирующей последовательности. Путем инактивации старт-кодонов кодирующей последовательности MCRS1 мы выяснили, что второй старт-кодон задействован в инициации трансляции примерно с той же эффективностью, что и первый.

Публикации