Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Цель проекта заключалась в выяснении механизмов, ответственных за формирование факультативного гетерохроматина. Ранее мы показали, что в нейронах дрозофилы ламина-ассоциированные домены хромосом (ЛАДы) обогащены связыванием HP1a, а частота встречаемости мобильных элементов (МЭ) в ЛАДах выше, чем в меж-ЛАДах (Pindyurin et al., 2018). Последнее наблюдение указывало на возможное участие МЭ в привлечении HP1a в нейрональные ЛАДы. Поэтому в первой части работы мы проверяли, нарушается ли привлечение гетерохроматинового белка HP1a в нейрональные ЛАДы при деплеции основного компонента ядерной ламины - ламина Dm0, а также при мутации по ключевому компоненту эндо-siРНК пути Ago2, приводящей к дерепрессии МЭ в мозге дрозофилы. С этой целью методом DamID мы построили профили HP1a в мозге личинок на фоне этих воздействий. Биоинформатический анализ полученных профилей показал, что деплеция ламина Dm0 в нейронах приводит не к ослаблению, как мы ожидали, а наоборот, к усилению связывания HP1a с МЭ. Кроме того выяснилось, что при деплеции ламина происходит усиление связывания HP1a не только с МЭ, но и с ЛАДами, и с перицентромерным гетерохроматином, насыщенным повторами и МЭ. Поскольку деплеция ламина Dm0 приводит к удалению периферического гетерохроматина от ядерной оболочки в эмбриональных клетках S2 дрозофилы (Ulianov et al., 2019), можно предположить, что то же самое происходит и в нейронах. Согласно литературным данным, в клетках млекопитающих утрата связи между ядерной оболочкой и периферическим гетерохроматином, обогащенным H3K9me2/3, возникающая, например, при клеточном старении, вызванном активацией онкогенов (oncogene-induced senescence; Lenain et al., 2015), часто сопровождается агрегацией H3K9me2/3-модифицированного гетерохроматина с образованием фокусов внутри ядра (senescence-associated heterochromatin foci (SAHF); Narita et al., 2003). При этом контакты между агрегированными районами гетерохроматина резко усиливаются (Chandra et al., 2015). Вполне вероятно, что агрегация гетерохроматиновых районов усиливает связывание HP1 с этими районами, что мы и наблюдаем в нейронах дрозофилы. Другое важное заключение, которое мы сделали в ходе выполнения этой части проекта, состоит в обнаружении резкого ослабления связывания белка-репрессора HP1a с МЭ на фоне мутации в гене, кодирующем Ago2. Отметим, что это заключение носит предварительный характер, поскольку резкое снижение HP1a на МЭ мы наблюдали только в одной повторности данного эксперимента. Каким образом Ago2 может привлекать HP1a на МЭ остается неизвестным. Иммуноокрашивание политенных хромосом антителами к Ago2 и данные ChIP-seq в клетках S2 с этими же антителами не показали заметного связывания Ago2 с МЭ и с перицентромерными районами хромосом (Moshkovich et al., 2011; Cernilogar et al., 2011). Однако в недавней работе, где был проведен ChIP-seq в головах мух антителами к Ago2, сайты связывания этого белка в перицентромерных районах хромосом все же были выявлены (Lee et al., 2018). В этой же работе методом ChIP-seq в головах мух было обнаружено резкое снижение связывания HP1a с перицентромерными районами хромосом на фоне мутации по Ago2. При этом, в перицентромерном гетерохроматине было детектировано на порядок больше сайтов, в которых произошло ослабление связывания HP1a, чем сайтов связывания самого Ago2 (Lee et al., 2018). Авторы предположили, что Ago2 участвует в привлечении HP1a только к тем сайтам перицентромерного гетерохроматина, в которых находится сам, после чего происходит распространение HP1a на соседние участки гетерохроматина, в которых Ago2 не локализуется. Наши результаты, полученные методом DamID, который является альтернативой методу ChIP-seq, также свидетельствуют о резком снижении связывания HP1a с перицентромерным гетерохроматином в нейронах дрозофилы на фоне мутации по Ago2. В совокупности, наши результаты и результаты (Lee et al., 2018) указывают на участие Ago2 в подавлении МЭ в нейронах путем привлечения HP1a к хроматину МЭ. Следует подчеркнуть, что транскрипционный механизм репрессии МЭ в соматических клетках негонадной природы ранее был неизвестен у дрозофилы. Во второй части работы мы проверяли предположение, согласно которому связывание активатора транскрипции с районом факультативного гетерохроматина в нейронах дрозофилы приводит к ослаблению контактов этого участка хроматина с ядерной ламиной. С помощью количественного ПЦР-анализа геномной ДНК, выделенной из мозга личинок, в клетках которого проходило Dam- и Dam-Lamin-метилирование, мы получили предварительное указание на то, что при связывании активатора GAL4 с UAS-элементом, интегрированным в один из нейрональных ЛАДов, происходит локальная утрата связи этого сайта с ядерной ламиной. Таким образом, механизм, при котором активированные локусы открепляются от ядерной оболочки, вероятно действует и в неделящихся клетках дрозофилы, таких как нейроны. На следующем этапе проекта предполагается проверить методом FISH, происходит ли в нейронах перемещение ЛАДа, содержащего UAS-элемент, от ядерной оболочки внутрь ядра после связывания активатора GAL4 с UAS-элементом. В третьей части работы мы проверяли предположение о сиквенс-специфичном распознавании участков факультативного гетерохроматина, прикрепленных к ядерным порам через нуклеопорин Elys. Одна из задач этой части проекта состояла в определении геномных сайтов связывания Elys в нейронах дрозофилы. Сопоставление этих сайтов с определенными нами сайтами Elys в поздних эмбрионах дрозофилы (Doronin et al., 2024) позволило бы оценить степень вариабельности сайтов Elys в разных типах клеток. При этом предполагалось, что низкий уровень вариабельности будет свидетельствовать о преимущественно сиквенс-специфичном распознавании Elys своих геномных мишеней. После того, как мы перепробовали нескольких разных конструкций для проведения DamID с Elys, в конце данного отчетного периода нам наконец удалось подобрать подход на основе TaDa-вектора (Southall et al., 2013), который, как мы надеемся, позволит получить адекватный профиль связывания Elys с геномом в нейронах дрозофилы. Генетическое объединение конструкций для DamID с Elys на основе TaDa-вектора с новыми трансгенными сайтами связывания Elys, которое было сделано в этом году, должно позволить нам в следующем году проверить, появляется ли сайт связывания Elys в новом месте при переносе в это место последовательности ДНК из другого сайта? Кроме того, нас интересует, зависит ли появление этого нового сайта от присутствия в его последовательности A/T-богатых участков, с которыми потенциально мог бы связываться Elys?