Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В рамках работ 2 года проекта были решены задачи связанные с синтезом галогенированных вариантов тирозина, оптимизацией системы для трансляционной вставки неканонических аминокислот, получением целевых белков и подтверждением замены с помощью масс-спектрометрии. Это позволило нам получить 5 новых классов объектов для исследования их функциональных свойств. В 2024 году нами подготовлено четыре новые статьи, три из которых прошли рецензирование в научных журналах (все Q1), и создан задел для еще как минимум трех публикаций. Модификация взаимодействий каротиноида и группы водородных связей в оранжевом каротиноидном белке ОСР за счет замены единственного атома в тирозине-201 на хлор, бром или йод позволили получить набор белков более вариативный по своим спектральным свойствам, выходу фотопродукта и кинетике фотоцикла чем все известные представители природных семейств ОСР. В результате модификаций остатка тирозина-134 в белке UnaG нам удалось получить набор белков с идентичными спектрами флуоресценции, но сокращенными временами жизни флуоресценции в диапазоне от 200 пс до 2.0 нс. Отработана методика получения холо-формы белка in vitro и проведены эксперименты по изучению стационарных и время-разрешенных характеристик UnaG. Понимание характерных различий новых вариантов UnaG позволило нам использовать химерные конструкции на их основе для визуализации клеточных компартментов с помощью микроскопии, основанной на регистрации времени жизни флуоресценции (FLIM). Данный вариант генетически кодируемого флуоресцентного мечения не требует созревания белка в присутствии кислорода или доставки экзогенных красителей, а также открывают новые возможности для визуализации распределения билирубина в живых клетках. Проводятся скрининговые эксперименты для подбора условий кристаллизации наиболее интересных вариантов белка. Были получены модификации флуороген-активирующего белка FAST, для которых были подобраны специфические замены, в том числе с использованием неканонических аминокислот. Палитра белков хорошо зарекомендовала себя в качестве надежных флуоресцентных меток для визуализации различных клеточных компартментов с помощью FLIM. Были отработаны методы получения объемных изображений клеток за счет регистрации времен жизни возбужденных состояний белков FAST. Получены модификации GFP-подобных белков с включением неканонической аминокислоты в хромофор. Вариант белка KillerRed с включением йода в хромофор характеризуется меньшей эффективностью созревания красной формы и увеличением длительности возбужденных состояний как в зеленой, так и в красной форме. Получены оценки способности таких белков к генерации триплетных состояний и активных форм кислорода. Также проводятся эксперименты по кристаллизации белка для изучения его пространственной структуры. Отработаны методы введения неканонических аминокислот, подходящих для селективного мечения белка с помощью клик-химии. Получен флуоресцентно-меченый вариант белка восстановления флуоресценции, способный взаимодействовать с ОСР с образованием комплекса. В дальнейшем планируется подобрать краситель таким образом, чтобы обеспечить эффективный перенос энергии электронного возбуждения на каротиноид в составе ОСР для изучения белок-белковых взаимодействий.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В рамках работ 3 года проекта мы продолжили оптимизацию методов одновременной визуализации нескольких клеточных структур с помощью метода FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) - микроскопии по времени жизни флуоресценции. Кроме белка UnaG, связывающего билирубин, для этих целей мы использовали семейство других флуороген-активирующих белков - FAST. Нашей ключевой задачей было подобрать метки (белки FAST с различными мутациями), которые флуоресцируют с значительно различающимся временем жизни. В качестве «красителя» (флуорогена) мы выбрали соединение N871b: оно фотостабильно и подходит для длительных наблюдений. В итоге мы отобрали четыре варианта мутантных белков с хорошо различимыми временами жизни — от 680 до 1250 пикосекунд. Это позволило нам раздельно видеть сигнал от одного красителя в ядре, митохондриях и элементах цитоскелета в одной клетке. Однако мы показали что при такой визуализации могут возникать артефакты: собственная флуоресценция клеточных компонентов («автофлуоресценция») может маскировать сигнал меток. Особенно это заметно вне ядра - например, в митохондриях или волокнах виментина. Чтобы отделить полезный сигнал, мы построили калибровочную зависимость времени жизни флуоресценции от яркости свечения в каждом пикселе изображения, позволяющую оценивать вклад автофлуоресценции. Кроме того, мы испытали возможность включения в белок FAST галогенированных аналогов тирозина (3‑хлор‑ и 3‑йод‑тирозинов). Эти замены меняют взаимодействие флуорогена с белком и расширяют палитру меток для FLIM-микроскопии. Таким образом, мы показали что и FAST и UnaG могут быть дополнительно оптимизированы с помощью трансляционного введения неканонических аминокислот и мультиплексирования сигналов FLIM-микроскопии. Параллельно нами изучались свойства флуоресцентного белка Katushka2S и мутанта с введением 3‑йод‑тирозина в хромофор. В препарате белка дикого типа и мутанта присутствуют разные формы хромофора - синей, зелёной и красной, - которые по‑разному реагируют на возбуждение светом, рН и температуру. Мутация Y68IY сдвигает спектр поглощения, увеличивает долю синих и зелёных форм и делает время жизни флуоресценции менее зависимым от температуры и рН. Наши данные помогают понять, как структура белка и пространственные ограничения вблизи хромофора, а также структура самого хромофора влияют на его спектральные характеристики. Для изучения фотоконверсии Katushka2S нами были проведены структурные исследования и установлена структура белка и хромофора в различных условиях. Понимание фотофизических и фото-химических реакций в флуоресцентных белках важно для разработки надежных и удобных меток для функциональной визуализации живых клеток. В результате работ 3 года было опубликовано 5 статей в журналах ASC Sensors, Biosensors, Photosynthesis Research (2 статьи) и BBA - Bioenergetics (все Q1). Важно отметить, что отработанные нами технологии расширения генетического кода были успешно внедрены в образовательную программу трех подразделений биологического факультета МГУ. В 2025 году были успешно защищены 1 бакалаврская и 2 магистерские работы, посвященные изучению свойств белков с неканоническими аминокислотами.