Регуляция активности футильных биоэнергетических циклов для стимуляции термогенеза и поглощения нутриентов в составе зрелых адипоцитов

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-75-10085

НазваниеРегуляция активности футильных биоэнергетических циклов для стимуляции термогенеза и поглощения нутриентов в составе зрелых адипоцитов

Руководитель Стафеев Юрий Сергеевич, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии имени академика Е.И. Чазова" Министерства здравоохранения Российской Федерации , г Москва

Конкурс №71 - Конкурс 2022 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-101 - Экспериментальная медицина

Ключевые слова Термогенез, адипоциты, ожирение, инсулиновая резистентность, CRISPR, футильные циклы

Код ГРНТИ34.15.41

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Футильные субстратные циклы в клетке, представляющие собой циклические последовательности ферментативных реакций, приводят к увеличению потребления АТФ и расходованию энергии, что представляет большой интерес для предотвращения развития энергетического дисбаланса при ожирении и сопутствующих метаболических осложнениях. Ожирение возникает в условиях постоянного превышения поступления энергетических субстратов над их затратами, приводя к увеличению объема белой жировой ткани, запасающей избыток энергии в виде триглицеридов (ТАГ). В противоположность белой жировой ткани, бурая и бежевая жировая ткань обладает способностью к поддержанию футильных циклов, обеспечивающих осуществление термогенеза и расходования энергии. Самым известным футильным циклом является цикл работы электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий и разобщающего белка UCP1, активность которого подтверждена в бурых и бежевых адипоцитах взрослого человека. Активация UCP1-зависимого термогенеза различными методами продемонстрировала высокую эффективность в борьбе с ожирением и метаболическими нарушениями in vivo. В то же время, существуют UCP1-независимые механизмы термогенеза, работающие за счет активации других футильных циклов. Среди описанных в настоящее время футильных циклов наибольшее значение в процессе термогенеза имеют: липидный цикл липолиза/липогенеза (который может включать укороченный цикл переэтерификации ТАГ или полный цикл окисления/de novo синтеза жирных кислот), цикл фосфорилирования/дефосфорилирования креатина в межмембранном пространстве митохондрий и цикл SERCA2b-зависимого транспорта Ca2+ в ЭПР. В отличие от UCP1-зависимого термогенеза, вклад неканонических механизмов в диссипацию избыточной энергии при метаболической перегрузке адипоцитов до сих пор неизвестен. Мы предлагаем оценить возможность активации футильных циклов (липидного и креатинового) в адипоцитах с помощью системы CRISPRa для увеличения потребности клеток в синтезе АТФ и поглощении высокоэнергетических субстратов. Важнейшим преимуществом предлагаемого подхода для активации термогенеза является отсутствие необходимости в дополнительной b3-адренергической стимуляции, продолжительное системное использование которой может приводить к побочным эффектам в лице развития артериальной гипертонии и сопутствующих осложнений. Активация футильных циклов превращения триглицеридов и фосфорилирования креатина позволят оценить возможность применения CRISPRa системы для изменения метаболических путей в клетках. Будет проведен детальный анализ метаболизма модифицированных клеток по активности митохондрий, ферментов гликолиза и цикла Кребса, получена более полная информация о механизмах работы футильных циклов в адипоцитах. При сравнение двух различных механизмов термогенеза мы определим, какой предпочтительный энергетический субстрат термогенные клетки используют для выполнения своей функции. Полученная информация позволит предположить роль исследуемых клеток в системном метаболизме: активация поглощения глюкозы может улучшать толерантность к глюкозе, в то время как поглощение жирных кислот может предотвращать эктопическое отложение липидов при ожирении. На основе модифицированных клеток будет разработан подход для создания тканеинженерных конструкций из метаболически активных жировых клеток. Клетки будут трансплантированы в виде 3D-конструкций на основе Матригеля. Мы проанализируем эффект тканеинженерных конструкций на системный метаболизм животных, содержащихся на низкожировой и высокожировой диетах, определим, влияние на развитие ожирения, чувствительность к инсулину и толерантность к глюкозе, кроме того, оценим влияние трансплантированных клеток на состояние инсулин-зависимых тканей животных. Полученные результаты позволят оценить возможность специфической активации футильных циклов в жировых клетках и применения таких клеток для изменения системного метаболизма животных.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Мичурина С.С., Стафеев Ю.С., Болдырева М.А., Труонг В.А., Ратнер Е.И., Меньшиков М.Ю., Ху Ю.Ч., Парфёнова Е.В. Transplantation of Adipose-Tissue-Engineered Constructs with CRISPR-Mediated UCP1 Activation International Journal of Molecular Sciences, 24, 3844 (год публикации - 2023)
10.3390/ijms24043844

2. Мичурина С.С., Стафеев Ю.С., Болдырева М.А., Труонг В.А., Меньшиков М.Ю., Ху Ю.Ч., Парфенова Е.В. ВЛИЯНИЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ АДИПОЦИТОВ С ПОВЫШЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ТЕРМОГЕНИНА НА МЕТАБОЛИЗМ МЫШИ Сборник тезисов конференции Кардиология на марше 2023 (год публикации - 2023)

3. Стафеев Ю.С., Болдырева М.А., Мичурина С.С., Агарева М.Ю., Раднаева А.В., Меньшиков М.Ю., Ху Ю.Ч., Макаревич П.И., Парфёнова Е.В. ЭФФЕКТИВНОСТЬ КОМБИНИРОВАННОЙ ПЛАЗМИДЫ HGF/VEGF В ГЕННОЙ ТЕРАПИИ ИШЕМИИ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ НА ФОНЕ НАРУШЕННОЙ ТОЛЕРАНТНОСТИ К ГЛЮКОЗЕ Сборник тезисов III конференции "Фундаментальная и клиническая диабетология в XXI веке: от теории к практике" (год публикации - 2023)

4. Миурина С.С., Агарёва М.Ю., Ратнер Е.И., Меньшиков М.Ю., Стафеев Ю.С., Парфёнова Е.В. The simple method of lipolysis/lipogenesis balance assessment based on 14C isotope: advances and importance of pH control Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry, Vol.333 (год публикации - 2023)
10.1007/s10967-023-09198-4

5. Стафеев Ю.С., Мичурина С.С., Болдырева М.А., Агарёва М.Ю., Труонг В.А., Меньшиков М.Ю., Ху Ю.Ч., Парфёнова Е.В. Использование нередактирующих CRISPR систем для активации канонического и неканонического термогенеза белых адипоцитов Гены и клетки, Том 18, Приложение 1, с.44 (год публикации - 2023)

6. Мичурина С.С., Агарёва М.Ю., Зубкова Е.С., Меньшиков М.Ю., Стафеев Ю.С., Парфёнова Е.В. IL-4 activates the futile triacylglyceride cycle for glucose utilization in white adipocytes Biochemical Journal, T.481, №4, с.329–344 (год публикации - 2024)
10.1042/BCJ20230486

7. Мичурина С.С., Белоглазова И.Б., Агарёва М.Ю., Алексеева Н.В., Парфёнова Е.В., Стафеев Ю.С. Creation of Genetically Modified Adipocytes for Tissue Engineering: Creatine Kinase B Overexpression Leads to Stimulated Glucose Uptake and Mitochondrial Potential Growth, but Lowered Lipid Synthesis Life, T.15, №5, номер статьи 753 (год публикации - 2025)
10.3390/life15050753

8. Мичурина С.С., Стафеев Ю.С., Белоглазова И.Б., Гольцева Ю.Д., Дергилев К.В., Парфенова Е.В. Активация термогенных футильных циклов в адипоцитах при гиперэкспрессии креатинкиназы В и глицеролкиназы Сборник "Биоинформатика регуляции и структуры геномов/системная биология: Четырнадцатая международная мультиконференция" , Т.36, стр.1560-1562 (год публикации - 2024)

9. Мичурина С.С., Стафеев Ю.С., Агарёва М.Ю., Белоглазова И.Б., Парфёнова Е.В. Активация экспрессии креатинкиназы В и глицеролкиназы для создания термогенных адипоцитов Морфология, 2024;Материалы VI Национального конгресса по регенеративной медицине [электронный ресурс]:661-662. (год публикации - 2024)
10.17816/morph.konf2024

10. Мичурина С.С., Белоглазова И.Б., Агарева М.Ю., Мохаммад Р., Алексеева Н.В., Парфёнова Е.В., Стафеев Ю.С. Гиперэкспрессия глицеролкиназы подавляет синтез липидов, но повышает мембранный потенциал митохондрий и активность термогенеза в адипоцитах Биохимия (год публикации - 2025)

11. Стафеев Ю.С., Парфёнова Е.В. Клеточная терапия метаболических заболеваний с использованием графтов адипоцитарного происхождения: экспериментальные подходы и клинические перспективы Сахарный диабет (год публикации - 2025)

12. Стафеев Ю.С., Мичурина С.С., Агарева М.Ю., Белоглазова И.Б., Ратнер Е.И., Меньшиков М.Ю., Парфёнова Е.В. Creation of prometabolic thermogenic adipocytes based on activation of futile cycles for tissue engineering Diabetes Technology & Therapeutics, Vol.27, S.2, pp.e421 (год публикации - 2025)
10.1089/dia.2024.78502.abstracts

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В отчетном периоде было показано, что гиперэкспрессия GyK снижает включение экзогенных жирных кислот в липидные капли, что может свидетельствовать об отсутствии стимуляции ТАГ цикла. Также гиперэкспрессия GyK оказывает менее выраженный эффект на количество меченой жирной кислоты в липидных каплях и их морфологию по сравнению с агонистом β-адренорецепторов. Также был проведен анализ маркеров захвата инсулин-зависимого захвата глюкозы и липогенеза в адипоцитах при гиперэкспрессии GyK, было показано, что гиперэкспрессия GyK ингибирует экспрессию участников каскада инсулин-зависимого транспорта глюкозы (AS160) и стимулирует фосфорилирование киназы Akt. В отчетном периоде был проведен анализ метаболической активности адипоцитов с гиперэкспрессией CKB. Анализ митохондриального метаболизма показал статистически достоверное увеличение базального дыхания у адипоцитов с гиперэкспрессией CKB. Анализ закисления внеклеточной среды продемонстрировал усиление активности гликолитического метаболизма адипоцитов с гиперэкспрессией CKB. Для более подробного анализа причин метаболических изменений в адипоцитах при гиперэкспрессии CKB мы проводили анализ экспрессии липидных и митохондриальных молекулярных маркеров в зрелых адипоцитах с гиперэкспрессией CKB. Анализ уровня экспрессии ATGL продемонстрировал небольшое увеличение уровня экспрессии ATGL в адипоцитах с гиперэкспрессией CKB. SREBP1 усиливал экспрессию при модификации зрелых адипоцитов геном CKB. Экспрессия Complex V существенно возрастает при гиперэкспрессии CKB. Таким образом, анализ метаболической активности адипоцитов и маркеров метаболизма липидов и митохондрий в зрелых адипоцитах с гиперэкспрессией CKB продемонстрировал отсутствие активации процесса термогенеза в адипоцитах и усиление процессов синтеза АТФ. Далее план работ отчетного периода был несколько модифицирован. На данном этапе работы было принято решение при переходе к in vivo работам в модели высокожировой диеты использовать подход прямой генной терапии. Для этого были созданы лентивирусные конструкции с геном GyK аналогично работам предыдущего отчетного периода в клетках HEK293T. Далее в работе использовали самцов мыши линии C57BL\6J 6 недельного возраста. Данных животных рандомизировали на 5 групп: LFD (низкожировая диета), LFD GyK (низкожировая диета с инъекцией вируса для гиперэкспрессии GyK в жировую ткань), HFD (высокожировая диета), HFD Lego (высокожировая диета с инъекцией пустого лентивируса в жировую ткань), HFD GyK (высокожировая диета с инъекцией вируса для гиперэкспрессии GyK в жировую ткань). Впоследствии проводили введение стокового раствора вируса в подкожную жировую ткань мыши в соответствующих группах и начинали процесс индукции различных диет. Было продемонстрировано, что гиперэкспрессия GyK в жировой ткани предотвращает набор веса в условиях низкожировой диеты, но не высокожировой диеты. Кроме того, гиперэкспрессия GyK в жировой ткани не оказывает значимого влияния на уровень глюкозы крови натощак вне зависимости от диеты. Гиперэкспрессия GyK в жировой ткани несколько снижает температуру тела животных в условиях низкожировой диеты, а также не влияет на поглощение пищи в условиях обоих диет. Гиперэкспрессия GyK в жировой ткани в модели высокожировой диеты не оказывает значимых эффектов на толерантность к глюкозе, однако наблюдается существенное усиление толерантности к глюкозе в условиях низкожировой диеты при гиперэкспрессии GyK в жировой ткани. Гиперэкспрессия GyK в жировой ткани в модели высокожировой диеты никак не влияет на инсулиновую чувствительность животных, однако в модели низкожировой диеты гиперэкспрессия GyK в жировой ткани ведет к усилению инсулиновой чувствительности у животных. Таким образом, гиперэкспрессия GyK ведет к усилению толератности к глюкозе и инсулиновой чувствительности в условиях низкожировой диеты. Анализ морфологии адипоцитов подкожной жировой ткани продемонстрировал больший размер адипоцитов подкожного жира в условиях высокожировой диеты, однако гиперэкспрессия GyK в подкожном жире значимо не меняет размер адипоцитов в условиях высокожировой диеты. В условиях низкожировой диеты гиперэкспрессия GyK в подкожном жире при низкожировой диеты приводила к достоверному увеличению размеров адипоцитов. Для висцерального жира было показано, что высокожировая диета вызывает существенное увеличение размера висцеральных адипоцитов. Тем не менее, в условиях как низкожировой, так и высокожировой диет, гиперэкспрессия GyK в подкожной жировой ткани никак не влияет на размер адипоцитов висцерального жира. Анализ окрашивания и морфологии скелетной мышцы демонстрирует нормальную морфологию скелетной мышцы и отсутствие жировой инфильтрации мышцы во всех группах. В случае печени в модели высокожировой диеты мы наблюдали жировую инфильтрацию, детектируемую с помощью красителя OilRedO, в условиях низкожировой диеты данная инфильтрация отсутствует. Анализ захвата глюкозы демонстрирует, что базальный захват глюкозы снижается в модели высокожировой диеты как в подкожной, так и в висцеральной жировых тканях, что тесно коррелирует с высокой гликемией у данных животных. Анализ захвата глюкозы в низкожировой диете продемонстрировал, что гиперэкспрессия GyK в подкожной жировой ткани существенно усиливает захват глюкозы в подкожной жировой ткани. Анализ экспрессии целевого трансгена в висцеральной и подкожной жировой ткани продемонстрировал усиленную экспрессию GyK в подкожном жире и отсутствие экспрессии GyK в висцеральном жире. Уровень мРНК ATGL был существенно ниже у животных с ожирением по сравнению с низкожировой диетой, но гиперэкспрессия GyK не оказывала значимого влияния на экспрессию мРНК ATGL. FSP27 представляет собой белок, стимулирующий слияние липидных капель и увеличение их размера. Экспрессия мРНК данного гена была существенно выше в случае высокожировой диеты как в подкожном, так и в висцеральном жире, что тесно связано с увеличенным размером адипоцитов при высокожировой диете. Однако, экспрессия мРНК FSP27 больше в условиях низкожировой диеты в подкожном жире при гиперэкспрессии GyK, что согласуется с данными по размерам адипоцитов. Таким образом, гиперэкспрессия GyK в подкожной жировой ткани стимулирует захват глюкозы в условиях низкожировой диеты, а также усиливает экспрессию маркера слияния жировых капель FSP27. Таким образом, результаты работы по гиперэкспрессии GyK в подкожной жировой ткани in vivo свидетельствуют в пользу трансляционного потенциала прямой генной терапии с помощью гиперэкспрессии GyK в подкожной жировой ткани для модуляции свойств жировой ткани в комбинации с диетарной интервенцией (поддержанием низкожировой диеты).

Публикации

Возможность практического использования результатов
Результаты проекта могут быть использованы в создании генно-терапевтических инструментов для контроля метаболизма при ожирении и сахарном диабете 2 типа, которые являются наиболее распространенными коморбидностями сердечно-сосудистых заболеваний и занимают важное место в структуре смертности населения РФ.