КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер проекта 22-75-00066
НазваниеРазработка методических подходов к экспресс-оценке чувствительности бактерий к антибиотикам при помощи методов флуоресцентной микроскопии и флуориметрии
Руководитель Алиева Камилла Натиговна, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф.Гаузе" , г Москва
Конкурс №70 - Конкурс 2022 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными
Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-109 - Клиническая лабораторная диагностика и нанотехнологии в медицине
Ключевые слова Флуоресцентная микроскопия, флуориметрия, флуоресцентные красители, патогенные бактерии, антимикробная активность антибиотиков, резистентность бактерий к антибиотикам
Код ГРНТИ34.27.00, 34.27.05
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
В клинической практике для определения чувствительности возбудителя инфекционного заболевания к антимикробному препарату используются традиционные культуральные методы: диско-диффузионный метод, E-тест, инструментальные методы. Они позволяют получить результат в течение минимум 18-24 часов. При тяжёлых состояниях пациентов, инфицированных нозокомиальными штаммами бактерий (бактериемия или вентилятор-ассоциированная пневмония), определение чувствительности микроорганизма необходимо проводить в самые короткие сроки для выбора схемы антимикробной терапии.
Такую возможность открывают оптические методы – флуоресцентная микроскопия и флуориметрия, позволяющие в реальном времени (in situ) количественно оценивать численность жизнеспособных клеток патогенных бактерий, окрашенных при помощи флуоресцентных красителей, в присутствии антибиотика. Согласно результатам опубликованных к настоящему времени исследований, применение таких методов позволяет сократить время оценки значения минимальной подавляющей концентрации (МПК) антибиотика до 2-6 часов в зависимости от вида бактерии и антибактериального препарата. Преимуществом флуориметрии перед флуоресцентной микроскопией является возможность одновременного анализа чувствительности к антибиотикам большого количества штаммов в стандартных условиях. Оба метода обладают высокой надежностью и точностью.
Флуоресцентные красители способны избирательно проникать в живые или мертвые клетки прокариотических организмов, специфически связываться с определенными структурами-мишенями клетки (например, ДНК, РНК) либо, подвергаясь клеточному метаболизму (гидролиз, окисление), трансформироваться, образуя в флуоресцирующие комплексы. Благодаря таким свойствам флуоресцентных красителей можно дифференцировать клетки микроорганизмов по их физиологическому состоянию, оценивать численность живых и мертвых клеток бактерий в популяции, а также определять их физиологическую активность на ранних стадиях роста культуры в присутствии антибиотика. В опубликованных к настоящему времени работах для определения жизнеспособности клеток под воздействием антибиотика описано применение следующих флуоресцентных красителей: акридиновый оранжевый (определение чувствительности Escherichia coli к гентамицину и жизнеспособности Klebsiella pneumonia в присутствии амикацина); резазурин и комплекс красителей SYTO-9/пропидия йодид (использование в наборах для дифференцированного окрашивания живых и мертвых клеток прокариот); SynaptoGreen-C4 (определение чувствительности Yersinia pestis к ампициллину, ципрофлоксацину и доксициклину); кальцеин-АМ (определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к рифампицину).
Несмотря на имеющиеся данные, исследования по оценке применимости оптических методов для оценки чувствительности патогенных бактерий к антибиотикам немногочисленны, и многие пары бактерия-антибиотик в этом аспекте изучены не были. Для развития данного направления предстоит определить специфичность красителей для различных бактерий под воздействием антибиотиков разных групп и оценить роль фактора времени исследования для получения достоверных результатов. Это определяет научную новизну и значимость запланированного исследования, которое направлено на решение указанных вопросов.
Наряду с научной значимостью, исследование имеет и несомненную практическую ценность как поисково-направленное исследование, поскольку предполагает разработку методической базы, необходимой для экспресс-оценки чувствительности патогенных бактерий к антибиотикам. Сейчас для этих целей применяется оборудование от иностранных производителей с использованием альтернативных флуоресцентному окрашиванию методов ускоренной оценки МПК. В сложившейся обстановке возможность оснащения медицинских учреждений этими дорогостоящими и сложными в обращении приборами резко ограничена, в том числе по финансовым соображениям. В этой связи разработка методов экспресс-оценки чувствительности бактерий к антибиотикам, предлагаемая в данном исследовании, представляется весьма актуальным направлением исследованием.
Для изучения возможности in situ оценки значений МПК антибиотиков при помощи флуоресцентного окрашивания, будет выбран ряд красителей, применяемых для дифференциального окрашивания прокариотических клеток, таких как акридиновый оранжевый, резазурин, МТТ, комплекс красителей кальцеин-АМ /SytoxRed, комплекс SYTO-9/пропидия йодид, комплекс DAPI/SYTOXGreen или их аналоги. Объектами исследования будут антибиотики с бактериостатическим и бактерицидным действием, входящие в перечень рекомендованных для терапии инфекций, вызванных грамотрицательными микроорганизмами: меропенем, полимиксин В, колистин, амикацин (или гентамицин), тигециклин, фосфомицин, левофлоксацин. Также объектами исследования станут клинически значимые виды грамотрицательных бактерий, такие как Klebsiella pneumoniae и Pseudomonas aeruginosa, характеризующиеся различной чувствительностью к исследуемым антибиотикам.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ