Применение оптогенетической системы BphP1-QPAS1 в растениях

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-74-10118

НазваниеПрименение оптогенетической системы BphP1-QPAS1 в растениях

Руководитель Омелина Евгения Сергеевна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук , Новосибирская обл

Конкурс №71 - Конкурс 2022 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые слова оптогенетика, транскрипция, трансген, дозаривание, растения, ближний инфракрасный свет, BphP1, QPAS1

Код ГРНТИ34.57.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Одной из важнейших характеристик оптогенетических подходов является возможность пространственно-временной регуляции интересующего процесса с помощью света. В отличие от методов, индуцируемых химическими агентами, оптогенетические методы не токсичны, не имеют неспецифических эффектов и могут применяться в растениеводстве и производстве безопасных и качественных продуктов питания. Основным ограничивающим фактором развития оптогенетики в растениях является нежелательная активация оптогенетических систем на естественном дневном свете. В данном проекте мы впервые применим оптогенетическую систему BphP1-QPAS1, контролируемую ближним инфракрасным (ИК) светом (740-780 нм), в растениях. Использование ближнего ИК света является наиболее предпочтительным, поскольку этот свет не токсичен для эукариотических клеток, и обладает наибольшей проницаемостью в живые ткани. Кроме того, поглощение света растительными фитохромами и пигментами, заканчивается около 740 нм. Система BphP1-QPAS1 является идеальной для использования в растениеводстве, поскольку ее компоненты ортогональны клеткам растений, т.е. вероятность взаимодействия белков BphP1 и QPAS1 с эндогенными метаболическими путями растений минимальна. Также систему BphP1-QPAS1 можно сочетать с другими оптогенетическими системами, контролируемыми видимым светом, и с GFP-подобными флуоресцентными белками. Данный проект состоит из двух частей, в первой из которых работа системы BphP1-QPAS1 будет оптимизирована для снижения уровня нежелательной активации в темноте. Кроме того, для того, чтобы исключить активацию системы BphP1-QPAS1 на дневном (белом) свете, мы модифицируем данную систему путем добавления к ней LOV домен содержащего белка VVD, контролируемого синим светом. Для проверки и оптимизации работы модифицированной системы при дневном свете, в темноте и при облучении ближним ИК светом первую часть проекта мы планируем выполнять не на растениях, а на удобном модельном объекте - культивируемых клетках S2 Drosophila melanogaster. Данный объект был выбран потому, что в отличие от методики агроинфильтрации в растениях, все конструкции, несущие компоненты модифицированной системы, могут быть трансфицированы в клетки дрозофилы одновременно с помощью электропорации или трансфекционных реагентов. У руководителя и исполнителей данного проекта имеется большой опыт работы с культивируемыми клетками дрозофилы и включение данного этапа в проект очень упростит дальнейшую адаптацию системы BphP1-QPAS1 в растениях. После тестирования и оптимизации конструкций в культивируемых клетках дрозофилы, все конструкции будут сведены вместе в одном бинарном векторе с предварительной заменой последовательностей промоторов и терминаторов на растительные. Вторая часть данного проекта будет выполняться на растениях. Т-ДНК бинарный вектор, несущий компоненты системы BphP1-QPAS1 в комбинации с VVD, будет доставлен в листья Nicotiana benthamiana с помощью метода агроинфильтрации. Экспрессия репортерного гена будет проверена с помощью микроскопического анализа и ОТ-кПЦР. Далее будут продемонстрированы возможности применения системы BphP1-QPAS1 в растениях на примере запуска иммунного ответа на бактериальные патогены и белкового таргетинга (мечения) путем комбинации системы с однодоменными антителами. Кроме того, модифицированная система BphP1-QPAS1 будет использоваться для свето-индуцируемого дозаривания плодов Solanum lycopersicum. Репортерный ген будет заменен на гены, контролирующие биосинтез этилена. Индуцируемая ближним ИК светом экспрессия данных генов будет также проверена на листьях N. benthamiana с помощью методики агроинфильтрации. Затем мы планируем получить трансгенный томат, что позволит производить дозаривание плодов путем их облучения ближним ИК светом. В целом, оптогенетические подходы являются очень перспективными для эффективного и экологичного растениеводства. Оптогенетические подходы можно использовать для развития агротехнических методов, например для синхронизации процессов закладки почек, цветения и роста плодов у культурных растений. Необходимо отметить также возможное применение оптогенетики для фундаментальных исследований. Например, совмещение оптогенетических технологий с методами геномного редактирования CRISPR/Cas9 позволит проводить тканеспецифический нокаут генов для исследования их функций в определенных тканях растений на разных этапах развития. Данным проектом мы надеемся положить начало развитию высокотехнологичных оптогенетических подходов для выращивания безопасных и высокопродуктивных культурных растений на территории РФ.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Огиенко А.А., Омелина Е.С.,Былино О.В., Батин М.А., Георгиев П.Г., Пиндюрин А.В. Drosophila as a model organism to study basic mechanisms of longevity International Journal of Molecular Sciences, 23(19):11244 (год публикации - 2022)
10.3390/ijms231911244

2. Былино О.В., Огиенко А.А.,Батин М.А., Георгиев П.Г., Омелина Е.С. Genetic, Environmental, and Stochastic Components of Lifespan Variability: The Drosophila Paradigm International journal of molecular sciences (MDPI), том 25, номер 8, 4482 (год публикации - 2024)
10.3390/ijms25084482

3. Моторина Д.М., Галимова Ю.А., Баттулина Н.В., Омелина Е.С. Systems for targeted silencing of gene expression and their application in plants and animals International Journal of Molecular Sciences, 25(10), 5231 (год публикации - 2024)
10.3390/ijms25105231

4. Суркова Э.С. Модификация оптогенетической системы BphP1-QPAS1 для работы в табаке Nicotiana benthamiana Конференция "Ломоносов-2024", - (год публикации - 2024)
-

5. Суркова Э.С. Беспрецедентный пространственно-временной контроль экспрессии генов у растений на примере N. benthamiana Конференция "МНСК-2024", - (год публикации - 2024)
-

6. Огиенко А.А., Андреева Е.Н., Яринич Л.А., Пиндюрин А.В., Баттулина Н.В., Омелина Е.С. Expression pattern of the AB1-Gal4 driver in Drosophila third-instar larvae International Journal of Molecular Sciences (MDPI), 26(9): 3923, 2025 (год публикации - 2025)
10.3390/ijms26093923

7. Э.С. Суркова, Ю.А. Галимова, Н.В. Баттулина, Д.М. Моторина, Е.С. Омелина Modification of the BphP1-QPAS1 optogenetic system for gene expression regulation in Nicotiana benthamiana tobacco leaves using near-infrared light Вавиловский журнал генетики и селекции, - (год публикации - 2025)
-

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В ходе третьего года выполнения проекта были выполнены следующие работы и получены следующие научные результаты: 1) Работа системы BphP1-QPAS1 в комбинации с белком VVD была протестирована в листьях табака в условиях освещения, максимально имитирующих естественный цикл день/ночь (16 ч белый свет, 8 часов темнота). После агроинфильтрации листьев табака плазмидой, содержащей компоненты BphP1-QPAS1 в комбинации с белком VVD, табак инкубировали в климатостате в течение 48 часов, имитируя естественные условия день/ночь. Затем часть растений табака была перемещена под облучение ближним инфракрасным светом (780 нм) в течение 24 часов. Остальные растения инкубировали еще 24 часа в условиях освещения день/ночь. Однако, к сожалению, оптимизация условий освещения не привела к удалению нежелательной активности системы BphP1-QPAS1 при воздействии белого света. Чтобы решить эту проблему, мы сначала заменили N-концевой сигнал ядерной локализации (NLS) слабым сигналом NES в конструкции NLS-Gal4-QPAS1-VVD. Во-вторых, в этой же конструкции мы заменили последовательность, кодирующую белок VVD, на чувствительный к синему свету домен AsLOV2 из белка фототропин 1 Avena sativa. Этот домен несет на своем C-конце спираль Jα, которая при облучении синим светом разворачивается, отделяясь от основного кора LOV2 домена. Это свойство домена AsLOV2 используют для создания различных оптогенетических инструментов, соединяя C-концевую спираль Jα с различными пептидами. Облучение синим светом делает С-концевой пептид доступным для различных белок-белковых взаимодействий. В данной работе мы использовали несколько разных пептидов для соединения с Jα спиралью домена AsLOV2, что позволило реализовать две стратегии: (1) ядерный экспорт химерного белка NES-Gal4-QPAS1-AsLOV2-NES, индуцированный белым светом; (2) деградация химерного белка NES-Gal4-QPAS1-AsLOV2-degron под действием белого света. Для перемещения химерного белка NES-Gal4-QPAS1-AsLOV2-NES из ядра в цитозоль мы использовали два разных сигнала NES из ранее созданной библиотеки сигналов NES, которые в слиянии с AsLOV2 показали различную эффективность ядерно-цитоплазматической транслокации под действием синего света (Niopek et al., 2016; doi: 10.1038/ncomms10624). Для светоиндуцируемой деградации белка NES-Gal4-QPAS1-AsLOV2-degron мы использовали ранее описанную систему B-LID, несущую вариант дегрона RRRG (Bonger et al., 2014; doi: 10.1021/cb400755b). Мы трансформировали агробактерии плазмидами, несущими компоненты системы BphP1-QPAS1 в комбинации с доменом AsLOV2-NES/degron, после чего провели инфильтрацию листьев табака. Растения инкубировали в течение 48 часов в условиях имитации дня/ночи. После этого половину растений инкубировали под ближним ИК-светом в течение 24 часов, в то время как остальные продолжали расти в условиях имитации цикла день/ночь еще 24 часа. Стратегия, основанная на деградации, чувствительной к белому свету, позволила избежать нежелательной активации системы BphP1-QPAS1 при белом свете и в темноте. Мы наблюдали сильный сигнал pEGFP при ближнем инфракрасном свете и не обнаружили флуоресценции pEGFP в листьях растений, выращенных в стандартных условиях день/ночь. Стратегия, основанная на индуцированной белым светом ядерно-цитоплазматической транслокации, оказалась гораздо менее эффективной. Оба варианта сигналов NES демонстрировали флуоресценцию pEGFP при ближнем инфракрасном свете, а также в стандартных условиях день/ночь. Таким образом, при временной агроинфильтрации листьев табака наиболее эффективным оказался вариант системы BphP1-QPAS1 в комбинации с доменом AsLOV2-degron. Необходимо отметить, что в состав плазмиды, несущей данный вариант модифицированной системы BphP1-QPAS1 также входит ген устойчивости к канамицину NeoR/KanR для возможности проведения селекции и получения в дальнейшем трансгенных растений. 2) Мы отработали методику получения трансгенного томата, несущего встройку вышеописанной конструкции с компонентами системы BphP1-QPAS1 в комбинации с AsLOV2-degron и репортерным геном 5×UAS-mini35S-pEGFP. В качестве материала были использованы растения томата сорта Moneymaker (семена получены из ген. банка Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research, Гатерслебен, Германия). Для введения томата в культуру семена поверхностно стерилизовали, отмывали стерильной водой и проращивали на среде MS. Для селекции трансформантов экспланты предварительно тестировали на устойчивость к канамицину на средах с разными концентрациями канамицина. Для проведения трансформации использовали ночную культуру агробактерии A. tumefaciens. Была проведена серия экспериментов по агробактериальной трансформации томатов. После проведения кокультивации экспланты помещали на среду, содержащую канамицин для селекции трансгенных клеток и цефотаксим для устранения роста A. tumefaciens. Однако было обнаружено, что комбинация селективного антибиотика канамицина в концентрации и антибиотика цефатоксима, традиционно используемого для элиминации агробактерии, вызывает полную потерю морфогенетического потенциала растительных тканей: не наблюдалось образования каллуса и регенерации ни на одном из более тысячи эксплантов. Поэтому в дальнейших экспериментах нами был применен антибиотик Амоксиклав. Проведенные трансформации и культивирование в присутствии антибиотиков канамицина и Амоксиклава более 200 эксплантов позволили получить несколько десятков регенерантов. Высокий титр A. tumefaciens, содержащейся в межклетниках растительной ткани несмотря на использование Амоксиклава, не позволил провести ПЦР анализ для подтверждения трансгенного статуса полученных регенерантов. Поэтому был проведен анализ флуоресценции белка pEGFP в листьях предположительных трансформантов. Для индукции экспрессии репортерного гена pEGFP полученные регенеранты помещали под облучение ближним инфракрасным светом (780 нм) в течение 24 часов. Были проанализированы образцы, полученные от 11 регенерантов. В результате один из регенерантов показал выраженную флуоресценцию белка pEGFP, наблюдаемую во всех образцах, взятых с данного регенеранта. 3) Мы подготовили конструкции, содержащие кДНК генов Acs1a и RIN, для свето-нидуцируемого дозаривания плодов томатов. Для этого нами была выделена РНК из листьев томатов и синтезирована кДНК, были подобраны праймеры для наработки кДНК генов Acs1a и RIN и получены ПЦР-продукты выбранных транскриптов. Данные ПЦР-продукты были вставлены вместо последовательности репортера pEGFP в конструкцию, содержащую компоненты системы BphP1-QPAS1 в комбинации с AsLOV2-degron.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Мы полагаем, что в будущем модифицированная система BphP1-QPAS1 может быть применена для повышения устойчивости сельско-хозяйственных растений к неблагоприятным условиям среды, вредителям, вирусным заболеваниям.