Цельноклеточные бактериальные биосенсоры на основе гибридных, стрессовых промоторов для исследовательских и прикладных задач

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-74-10047

НазваниеЦельноклеточные бактериальные биосенсоры на основе гибридных, стрессовых промоторов для исследовательских и прикладных задач

Руководитель Баженов Сергей Владимирович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)" , г Москва

Конкурс №71 - Конкурс 2022 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-210 - Молекулярная генетика

Ключевые слова Бактерии, регуляция, промотор, гибрид, биосенсор

Код ГРНТИ34.15.27

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Настоящий проект посвящен изучению свойств бактериальных индуцируемых промоторов грамположительных бактерий Bacillus subtilis и грамотрицательных бактерий Escherichia coli, разработке новых гибридных промоторов для цельноклеточных биосенсоров. Новые биосенсоры будут использованы данном проекте для: исследования способности антибиотиков и биологически активных веществ к активации окислительного стресса в бактериальных клетках и способности ферритина защищать клетку от него; исследования механизмов токсичности каркасно-напряженных углеводородов; исследования влияния про- и антиоксидантных веществ на бактериальную клетку; исследования роли метионин-гамма-лиаз quorum sensing ответе патогенных бактерий. Планируется исследовать ряд стресс-индуцируемых промоторов бактерий B. subtilis и оценить их применимость для создания цельноклеточных биосенсоров и последующего анализа механизмов токсичности различных химических соединений и поиска токсикантов в загрязненных почвах, что невозможно выполнить с использованием ранее сконструированных биосенсоров на основе грамотрицательных E. coli. В результате выполнения проекта предполагается получить расширенный набор цельноклеточных биосенсоров на основе грамположительных и грамотрицательных бактерий и исследовать с его помощью токсичность и механизмы токсичности каркасно-напряженных углеводородов, являющихся перспективными компонентами ракетного топлива, а так же удобрения, некоторые моющие вещества и компоненты медицинских препаратов. Важность создания наборов цельноклеточных биосенсоров определяется 2 факторами: 1) исследование функции промоторов в клетках и их взаимной индукции; 2) создание инструмента для экологического контроля и определение биодоступных токсикантов в среде. Способность проводить оценку биодоступности токсикантов является ключевым преимущество бактериальных биосенсоров перед физическими методами определения химсостава сред. В рамках решения задачи по расширению набора цельноклеточных биосенсоров на основе грамотрицательных бактерий впервые предполагается сконструировать принципиально новый гибридный промотор на основе операторных участков промоторов оперонов isc и suf бактерий E. coli для создания цельноклеточного биосенсора, чувствительного к уровню окисленных/восстановленных Fe-S кластеров в клетке, который является индикатором окислительного стресса в клетке. Сочетание репрессии комплексом IscR-Fe-S и активации белком apo-IscR, как предполагается, приведет к получению улучшенных параметров цельноклеточного биосенсора, в частности обладающего повышенной чувствительностью, скоростью и амплитудой ответа на изменение концентрации восстановленных Fe-S кластеров в клетке. Так же планируется сконструировать биосенсор на основе промоторов генов dinA и dinB E. coli, кодирующих ДНК-полимеразы II и IV и являющегося индикатором SOS-ответа, а также биосенсор на основе промотора гена ftnA E. coli, кодирующего основной ферритин. В рамках решения задачи по расширению набора цельноклеточных биосенсоров на основе грамположительных бактерий предполагается сконструировать гибридные биосенсорные плазмиды на основе промоторов генов yneA, katB, katA, ucgJ (набор используемых промоторов может быть расширен в процессе выполнения работ). В рамках исследования различных химических соединений предполагается провести следующие работы: 1) Известно, что некоторые антибиотики способны вызывать окислительный стресс в бактериальных клетках. Это было показано на грамотрицательных бактериях. В рамках данного проекта будет проведена проверка воздействия этих антибиотиков на грамположительные клетки и основанные на них цельноклеточные биосенсоры. 2) Ряд медицинских препаратов может быть способен оказывать влияние на пул АТФ и НАДН в клетке. Предполагается исследовать эти процессы с помощью цельноклеточных биосенсоров с конститутивными промоторами и бактериальной и светлячковой люциферазами, светимость которых специфически зависит от концентрации НАДН и АТФ, соответственно. 3) Предполагается, что ферритин способен защищать клетку от окислительного стресса. Будет проведено исследование ферритина бактерий E. coli: будет изучена способность окислительного стресса влиять на его экспрессию, а также будет определена способность ферритина, продуцируемого внутри клеток E. coli защищать их от активных форм кислорода и повышать их устойчивость к окислителям и воздействию ряда антибиотиков. 4) Предполагается, что метионин-гамма-лиаза (МГЛ), являющаяся кандидатным ферментом для терапии рака, способна ингибировать работу системы чувства кворума (QS). В рамках проекта будут проведены исследования влияния MGL на работу QS системы Aliivibrio fischeri и Aliivibrio logei в гетерологичной системе клеток E. coli и QS системы в клетках A. logei. За работу QS системы I типа в бактериях A. fischeri и A. logei отвечают регуляторные белки LuxR-семейства. К настоящему моменту функция этих регуляторных белков из бактерий Aliivibrio достаточно хорошо изучена, в том числе группой авторов данной заявки, однако структуры этих белков все еще нет. В рамках настоящего проекта предполагается провести структурные исследования с целью улучшения понимания функции LuxR-белков и дальнейшей их модификации для решения биотехнологических задач. На завершающем этапе проекта будут проведены полевые испытания сформированного и охарактеризованного в лабораторных условиях набора цельноклеточных биосенсоров. В частности предполагается провести исследования ряда водоемов Подмосковья и принять участие в комплексной экологической экспедиции на оз. Байкал, организуемой институтом проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Баженов С.В., Новоятлова У.С., Щеглова Е.С., Празднова Е.В., Мазанко М.С., Кессених А.Г., Конончук О.В., Гнучих Е.Ю., Лью Ю., Аль Ибрахим Р., Завильгельский Г.Б., Чистяков В.А., Манухов И.В. Bacterial lux-biosensors: Constructing, applications, and prospects Biosensors and Bioelectronics: X, V. 13, 100323 (год публикации - 2023)
10.1016/j.biosx.2023.100323

2. Сударев В.В., Долотова С.М., Бухалович С.М., Баженов С.В., Рижиков Ю.Л., Уверский В.Н., Бондарев Н.А., Осипов С.Д., Михайлов А.Е., Куклина Д.Д., Муругова Т.Н., Манухов И.В., Рогачев, А.В., Горделий В.И., Гущин И.Ю., Куклин А.И., Власов А.В. Ferritin self-assembly, structure, function, and biotechnological applications International Journal of Biological Macromolecules, V. 224, Pages 319-343 (год публикации - 2023)
10.1016/j.ijbiomac.2022.10.126

3. Новоятлова У.С., Кудрявцева А.А., Баженов С.В., Уткина А.А., Фомин В.В., Невмянов Ш.А., Жошибекова Б.С., Федяева М.А., Колобов М.Ю., Манухов И.В. The Assessment of Methyl Methanesulfonate Absorption by Amphipods from the Environment Using Lux-Biosensors Biosensors, 14(9), 427 (год публикации - 2024)
10.3390/bios14090427

4. Матвеева В.О., Гребенникова А.Д., Сахаров Д.И., Фомин В.В., Манухов И.В., Баженов С.В. Oxidative Stress Leads to Fur-Mediated Activation of ftnA in Escherichia coli Independently of OxyR/SoxRs Regulators Journal of Basic Microbiology, e70038 (год публикации - 2025)
10.1002/jobm.70038

5. Матвеева В.О., Сахаров Д.И., Баженов С.В., Манухов И.В. Fur-регулируемые биосенсоры на основе промоторов PftnA и PfecA для мониторинга регуляции гомеостаза железа в клетке Биотехнология, том 41, № 2, с. 31–37 (год публикации - 2025)
10.56304/S0234275825020073

6. Новоятлова У.С., Кессених А.Г., Кононенко Н.В., Баранова Е.Н., Чалкин С.Ф., Баженов С.В., Манухов И.В. The capability of plant-bacterial consortia to reduce the genotoxicity of unsymmetrical dimethylhydrazine Bioremediation Journal, Стр. 1-11, doi: 10.1080/10889868.2025.2480714. Published online: 24 Mar 2025 (год публикации - 2025)
10.1080/10889868.2025.2480714

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
На третьем этапе выполнения проекта был собран единый набор цельноклеточных биосенсоров на основе грамотрицательных и грамположительных клеток, и проведены его испытания в лабораторных и экспедиционных условиях. В лаборатории с его применением были проведены исследования ряда новых химических соединений, имеющих различные области применения, от антибактериальных препаратов до компонентов ракетного топлива. Было показано, что набор эффективен при выявлении основных механизмов токсичности исследуемых веществ, что может быть востребовано как для усиления антибактериальных свойств синтетических веществ, так и, наоборот, снижения токсичности используемых в различных областях человеческой деятельности химикатов. На образцах растворов несимметричного диметилгидразина, обработанных бактериальными культурами и проростками кормовых трав было показано, что набор цельноклеточных биосенсоров применим не только для выявления факторов токсичности или загрязнений, но и для оценки эффективности методов детоксификации и ремедиации загрязненных мест (https://zanauku.mipt.ru/2025/04/04/soyuz-pochvennoj-bakterii-i-rasteniya-pomozhet-v-borbe-s-zagryazneniem-sredy-raketnym-toplivom/, https://ri.ria.ru/20250403/nauka-2008914713.html). Помимо исследований чистых веществ были проведены испытания набора в лабораторных условиях на образцах из нескольких Подмосковных водоемов и в экспедиционных условиях на образцах с о. Оленевский Белого моря и оз. Байкал. В результате сбора и биосенсорного анализа образцов в отдельных местах было выявлено наличие алкилирующих веществ: опасных соединений, способных повреждать ДНК и стимулировать мутагенез. В том числе токсичность проявлялась при анализе тканей бокоплавов, выловленных в местах, где наблюдается постепенное снижение их численности. Одним из ключевых результатов оказалось выявление способности амфипод накапливать в себе алкилирующие вещества (https://zanauku.mipt.ru/2024/09/20/bokoplavy-i-svetyashhiesya-bakterii-pomogli-otsenit-biologicheskie-effekty-mutagenov/), что подчеркивает необходимость улучшать контроль за загрязнениями окружающей среды. А также это дает новый инструмент, позволяющий по токсичности тканей гаммарусов обнаруживать загрязнение водоема алкилирующими соединениями в сверхнизких концентрациях. Были продолжены исследования регуляции экспрессии ферритина в условиях окислительного стресса. Это привело к разработке пары цельноклеточных биосенсоров, применение которых позволяет оценивать, как то или иное вещество влияет на гомеостаз железа в бактериальной клетке через мастер-регулятор Fur. Было показано, что независимо от функции основных регуляторов окислительного стресса OxyR и SoxR перекись и другие индукторы окислительного стресса приводят к последовательной активации активного транспорта железа в клетку, которая впоследствии сменяется репрессией транспорта и активацией запасания железа. На примере новобиоцина было продемонстрировано, что блокирующие гиразу антибиотики в нелетальных концентрациях вызывают окислительный стресс, сопровождающийся последовательными активациями транспорта железа в клетку и биосинтезом ферритина для его хранения. При этом существенно усиленная постоянная продукция ферритина не защищает клетку от повреждений перекисью водорода, однако оказывает незначительный положительный эффект на способность к росту клеток в присутствии малых концентраций новобиоцина. In vitro эксперименты с очищенным белком LuxR A. fischeri показали, что он достаточно эффективно связывает молекулы аутоиндуктора из окружающего раствора и способен к димеризации даже в отсутствие ДНК с соответствующим сайтом связывания. В рамках разработки гибридных промоторов на основе сайтов посадки для apo- и holo-IscR были сконструированы гибридные плазмиды аналогичные созданным на втором этапе, но не содержащие гена iscR. Был проведен сопоставительный анализ всех вариантов IscR-регулируемых промоторов, клонированных с геном-регулятором и без него. Было показано, что добавление гена-репрессора под контроль регулируемого им промотора вместе с генами-репортерами снижало базовую люминесценцию, что позволяет рассчитывать на некоторое повышение чувствительности системы. Добавление сайта посадки для белка в форме активатора (могут выступать как apo-, так и holo-IscR) приводило к повышению люминесценции и существенному снижению чувствительности системы.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Цельноклеточные биосенсоры, разработанные в рамках данного проекта, могут применяться для экологического мониторинга и токсикологических исследований. Отдельно можно выделить биосенсорные штаммы, позволяющие отслеживать регуляцию гомеостаза железа. Эти биосенсоры могут применяться для исследования биодоступности для бактериальных клеток различных форм железа, а также для исследования влияния различных медицинских препаратов и биологически активных веществ на гомеостаз железа в бактериальных клетках, составляющих основу микробиома кишечника человека.