Исследование механизмов ингибирования митохондриальной неспецифической Са2+-зависимой поры (mРТР) с помощью NAD(Н) и его биосинтетических предшественников со стороны цитозоля

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-74-00025

НазваниеИсследование механизмов ингибирования митохондриальной неспецифической Са2+-зависимой поры (mРТР) с помощью NAD(Н) и его биосинтетических предшественников со стороны цитозоля

Руководитель Харечкина Екатерина Сергеевна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук , Московская обл

Конкурс №70 - Конкурс 2022 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-205 - Клеточная биология, цитология, гистология

Ключевые слова Биомедицина, биоэнергетика, митохондриология, mРТР, пиридиновые нуклеотиды, NAD(H), адениновые нуклеотиды

Код ГРНТИ31.27.39

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Митохондриальная дисфункция сопровождает появление и развитие многих заболеваний, включая нарушения обмена веществ, протозойные инфекции, нейродегенеративные, нейромышечные болезни, диабет и ишемия с последующей реперфузией. Среди них ишемическая болезнь сердца и инсульт являются главными причинами смертности, инвалидности и утраты трудоспособности в современном обществе. Поэтому, разработка новых препаратов для цитопротекции сердца и мозга и способов коррекции постишемических повреждений органов, несомненно, является актуальной проблемой современной биомедицины. Ишемия, за которой следует реперфузия, индуцирует открывание во внутренней мембране митохондрий неспецифической Са2+-зависимой поры (mPTP). Данное явление приводит к повреждению внешней митохондриальной мембраны, увеличению ее проницаемости для апоптогенных факторов митохондрий, запуску клеточной гибели и повреждению органа. Согласно современным представлениям, открывание mPTP - ключевой фактор развития постишемической дисфункции. Cоответственно, mPTP является перспективной митохондриальной мишенью для предотвращения постишемических повреждений органов. К настоящему времени определены основные характеристики функционирования mPTP in vitro и in situ, идентифицированы некоторые её эндогенные и фармакологические модуляторы. Тем не менее, клинические испытания не подтвердили эффективность данных ингибиторов для облегчения последствий ишемии-реперфузии. Отсутствие обнадеживающих результатов указывает на то, что механизмы регуляции mPTP недостаточно изучены, не определены ее ключевые элементы. Кроме того, в последние годы получили развитие представления, согласно которым, клеточная гибель и необратимые повреждения органов при ишемии-реперфузии являются, в значительной мере, результатом биоэнергетического коллапса, вызванного повышенной деградацией NAD(H) и нарушением баланса NAD+/NADH в результате mPTP-индуцируемой активации NAD+-утилизирующих белков. Соответственно, активно изучается эффективность предшественников NAD(H) и ингибиторов PARP/SIRT в ослаблении тяжести последствий ишемии. И хотя данные, полученные с использованием животных моделей ишемии-реперфузии, выглядят весьма обнадеживающими, клинические испытания не подтвердили эффективность данной стратегии, что указывает на недостаточно четкое понимание механизмов действия NAD(H) и его предшественников. В то же время, наши собственные недавние исследования показали, что цитозольные NAD+ и NADH являются сильными эндогенными ингибиторами mPTP в дифференцированных клетках (Kharechkina E., 2019, 2021), что подразумевает совершенно другие механизмы активации постишемической клеточной гибели. Предлагаемый проект посвящен изучению нового направления в области регуляции mPTP: исследованию механизмов ингибирования mPTP пиридиновыми нуклеотидами (NADH и NAD+), а также их биосинтетическими предшественниками, со стороны цитозоля. В ходе выполнения настоящего проекта планируется изучить: 1) Эффект NADH, NAD+ и их биосинтетических предшественников, действующих со стороны цитозоля, на открывание mPTP в изолированных митохондриях печени, мозга, сердца и почек крыс. Это поможет определить орган(ы), наиболее чувствительные к действию изучаемых соединений и послужит выбору моделей для дальнейшего изучения. Кроме того, это поможет определить перспективные мишени при разработке терапии, основанной на подавлении mPTP через NAD(H)-связывающий сайт. 2) Механизм подавления mPTP цитозольным NAD(H), его связь с активацией/ингибированием ионного транспорта. Будет изучена NAD(H)-зависимая регуляция протонных утечек, а также транспорта калия с участием Са2+-зависимых и Са2+-независимых калиевых каналов и обменников во внутренней мембране митохондрий, т.е. процессов, регулирующих мембранный потенциал и объем митохондрий и, соответственно, прямо или опосредованно влияющих на индукцию mPTP. Это позволит выявить потенциальные мишени действия NAD(H) со стороны цитозоля. 3) Феномен (ранее не изученный) NAD(H)-зависимой активации выхода АТР и ADP (мощных ингибиторов mPTP) из митохондрий и его (пато)физиологическую роль. Планируется изучить основные биохимические характеристики NAD(H)-стимулируемого выхода адениновых нуклеотидов; с помощью ингибиторного анализа идентифицировать белок, ответственный за выход адениновых нуклеотидов (будут проверены ATP/ADP-транспортирующие и АТР/ADP-cинтезирующие белки); определить локализацию сайта действия NAD(H) - внешняя или внутренняя мембрана, межмембранное пространство (для этого будет сравнен эффект NADH и NAD в изолированных митохондриях и митопластах, а также в средах с разной тоничностью); изучить эффект NAD(H) на выход ATP/ADP из пермеабилизованных митохондрий, а также на устойчивость митохондрий к индукцию mPTP до и после удаления эндогенных адениновых нуклеотидов из митохондрий (преинкубация с фосфоенолпируватом). 4) Решение вышеуказанных задач позволит очертить круг кандидатов на роль NAD(H)-связывающего регулятора mPTР и перейти к его идентификации. В первую очередь, с использованием митохондрий и митопластов будет изучена локализация регуляторного сайта – внешняя мембрана или внешняя поверхность внутренней мембраны. При локализации регуляторного сайта во внешней мембране, его идентификация будет произведена с использованием аффинной хроматографии, регистрации автофлуоресценции NADH в полосах BN-PAGE гелей, и тандемной масс-спектрометрии. При локализации NAD(H)-связывающего регуляторного сайта в митопластах, планируется проводить масс-спектрометрический анализ супернатантов митопластов после обработки последних протеазами с параллельным контролем NAD(H)-зависимого подавления mPTP. Участие выявленных белков-кандидатов в подавлении mPTP будет верифицировано с использованием доступных ингибиторов и антагонистов, а также путем нокдауна или нокаута. 5) На заключительном этапе будет протестирована устойчивость клеток, экспрессирующих и не экспрессирующих NAD(H)-зависимый регулятор mРТР, к ишемии/гипоксии с использованием митохондриальных и клеточных моделей. Решение поставленных в проекте задач позволит идентифицировать новые механизмы участия пиридиновых нуклеотидов цитозоля в регуляции жизнеспособности клеток в физиологических и патологических состояниях. Полученные данные позволят начать поиск высокоэффективных фармакологических лигандов NAD(H)-зависимого регулятора mPTP и разработку новых способов терапии многих патологических состояний, в том числе, постишемических повреждений органов. Таким образом, предлагаемый проект направлен на решение важной медицинской, социальной и экономической проблемы.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ