КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

---

Номер проекта 22-25-00415

НазваниеИзучение способности интраназально вводимого инсулина предотвращать аутофагическую и апоптотическую гибель нейронов при двухсосудистой ишемии мозга и возможные механизмы его действия

Руководитель Аврова Наталия Федоровна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук , г Санкт-Петербург

Конкурс №64 - Конкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-106 - Нейробиология

Ключевые слова нейропротекция, инсулин, аутофагия, апоптоз, двухсосудистая ишемия мозга, реперфузия, гиппокамп, кора мозга, нейрональная культура, сигнальные пути

Код ГРНТИ34.15.43

---

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

---

Аннотация
В последние годы появились убедительные свидетельства того, что без понимания механизмов аутофагической гибели нейронов и их взаимосвязи с механизмами апоптотической гибели этих клеток невозможно достичь серьезных успехов в разработке подходов к лечению ишемических поражений мозга, в том числе инсультов. Основными причинами гибели нейронов при ишемическом поражении мозга являются некроз, апоптоз и аутофагия. При этом аутофагии принадлежит ключевая роль в поддержании клеточного гомеостаза. Однако защитные молекулярные механизмы аутофагии, в первую очередь в ЦНС, остаются недостаточно изученными, требуют дополнительных исследований. В настоящее время представления об исключительно защитной роли аутофагии пересмотрены. Четко прослеживается участие аутофагических процессов в гибели нейронов, прежде всего нейронов гиппокампа, что показано, в частности, при ишемии и реперфузии мозга. Во многих работах показано, что подавление аутофагической гибели нейронов способствует их лучшей сохранности при ишемических и других поражениях мозга. Показана способность многих нейропротекторов повышать жизнеспособность нейронов, ингибируя аутофагию при ишемии и реперфузии мозга. По данным Всемирной организации здравоохранения от цереброваскулярных заболеваний в мире ежегодно умирает около 5 млн человек. Из общего их числа 80-85 % приходится на инсульт мозга. Инсульт мозга является одной из основных причин тяжелой инвалидности и смерти людей в мире. Долгое время считали, что для понимания действия нейропротекторов достаточно расшифровать механизмы их антиапоптотического и антинекротического действия. Но сейчас стало совершенно ясно, что невозможно достичь понимания нарушений в мозге при ишемии и реперфузии и оценить действие на них нейропротекторов без исследования аутофагической гибели нейронов. В настоящее время считают, что сигнальные молекулы и внутриклеточные каскады, ответственные за регуляцию аутофагии, могут стать одной из важнейших терапевтических мишеней при лечении инсульта головного мозга и других форм его ишемического поражения. Основная задача в рамках проблемы, на решение которой направлен проект, заключается в изучении способности инсулина при его интраназальном способе введения, повышающем уровень этого гормона исключительно в ЦНС, снижать аутофагическую и апоптотическую гибель нервных клеток мозга крыс при двухсосудистой ишемии переднего мозга в сочетании с гипотензией и последующей реперфузией. Комплексный характер планируемого исследования заключается в том, что все выводы, сделанные на основании опытов in vivo, будут проверены в опытах на первичной культуре нейронов коры мозга. О комплексном характере исследований говорит и изучение взаимовлияния между путями активации аутофагии и апоптоза, которое будет изучено in vivo и in vitro. Защитный эффект инсулина при ишемии и реперфузии мозга может быть связан с ингибированием аутофагической гибели нейронов, но не с активацией аутофагии. Так, инсулин ингибирует активность АМФ-активируемой протеинкиназы (AMPK) в первичной культуре нейронов коры мозга, а активация этой протеинкиназы стимулирует процессы аутофагии. Кроме того, инсулин активирует протеинкиназы Akt 1 и mTOR, ингибирующие процессы аутофагии. Получены прямые свидетельства ингибирования инсулином аутофагии в экстраневральных органах и тканях. Эффект инсулина на аутофагическую гибель нейронов мозга при ишемических воздействиях и последующей реперфузии остается неизученным. И это, несмотря на огромный интерес к той роли, которую играет аутофагия в гибели нейронов при различных патологических процессах. И этот вопрос предстоит решить в рамках предлагаемого проекта. Способность коллектива успешно выполнить работу по проекту определяется тем, что исполнители проекта, включая молодых исследователей, владеют современными методами, необходимыми для выполнения проекта. Участники проекта имеют высокорейтинговые публикации Q1-квартиля, в которых представлены полученные с их помощью результаты. Для выполнения задач проекта будет проведена после окрашивания по Нисслю количественная оценка гибели нейронов гиппокампа и коры мозга у крыс с двухсосудистой ишемией мозга и последующей реперфузией, которым не вводили ингибиторы и которым будет введен интрацеребровентрикулярно ингибитор аутофагии 3-метиладенин (3-MA) и/или апоптоза z-VAD-FMK (пан-ингибитор каспаз). Если под влиянием введения 3-MA гибель нейронов гиппокампа и коры мозга существенно снизится, это покажет, что аутофагия является причиной гибели значительной части нейронов. Аналогично, если под влиянием z-VAD-FMK гибель нейронов гиппокампа и коры мозга заметно снизится, значит апоптотическая гибель нейронов вносит весомый вклад в общую их гибель. Будет также изучено влияние инсулина на жизнеспособность нейронов гиппокампа при двухсосудистой ишемии и реперфузиии. Контрольными животными во всех опытах in vivo будут ложно-оперированные крысы. Будет изучена способность инсулина при его интраназальном введении крысам предотвращать чрезмерную активацию аутофагии и связанную с этим гибель нейронов при двухсосудистой ишемии и реперфузии мозга. Для этого будет определена способность инсулина уменьшать уровень в лизатах гиппокампа и коры мозга крыс маркеров аутофагии (Beclin-1, LC3-II) и увеличивать уровень маркера p62, что будет изучено методом иммуноблоттинга. Экспрессия генов, кодирующих Beclin-1 и p62, будет изучена методом RT-PCR. Мы ожидаем, что инсулин будет нормализовать уровень маркеров аутофагии, повышенный при ишемии и реперфузии мозга или пониженный, в случае p62. Если при этом будет также показано, что аутофагическая гибель нейронов гиппокампа и коры мозга вносит существенный вклад в их общую гибель, то полученные нами данные будут первым свидетельством способности инсулина снижать аутофагическую гибель нейронов при ишемии и реперфузии мозга. Будет изучен антиапоптотический эффект инсулина при двухсосудистой ишемии и реперфузии мозга. Об апоптотической гибели нейронов мы будем судить, измеряя активность каспазы-3 и уровень фрагмента в 17-19 кДа этого фермента в лизатах гиппокампа и коры мозга. Полученные данные позволят определить степень апоптотического поражения нейронов гиппокампа и коры мозга при ишемии и реперфузии мозга и способность инсулина уменьшать их апоптотическую гибель. Будет изучено влияние ингибирования аутофагии введением 3-MA на уровень апоптотической гибели нейронов гиппокампа и коры мозга и влияние введения ингибитора апоптоза на экспрессию маркеров аутофагии в гиппокампе при ишемии и реперфузии мозга. Это позволит исследовать взаимодействие и координацию между процессами активации (или ингибирования) аутофагии и апоптоза в нейронах в условиях ишемического воздействия. Большой объем исследований будет проведен и на первичной культуре нейронов коры мозга. В качестве повреждающего агента, вызывающего окислительный стресс в нейронах, будет использоваться перекись водорода. Жизнеспособность нейронов будет определена с помощью МТТ- и ЛДГ-методов. Маркерами аутофагии будут служить Beclin-1, LC3 II и p62. Об апоптотической гибели нейронов будем судить по активации каспазы-3. Будет изучено влияние инсулина на аутофагическую и апоптотическую гибель нейронов. Взаимовлияние процессов аутофагии и апоптоза будет исследовано с применением ингибиторов аутофагии и апоптоза. Для выяснения механизмов предотвращения инсулином аутофагической гибели нейронов коры мозга будет изучено, от модуляции каких сигнальных путей зависит это воздействие. Планируемая работа является важным начальным этапом системного изучения влияния инсулина на аутофагические процессы в ткани мозга при ишемии и реперфузии. Она покажет перспективность и актуальность этих исследований, наметит дальнейшие планы работы и методические подходы к их реализации.

---

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

---