КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

---

Номер проекта 22-25-00310

НазваниеПовышение эффективности направленного редактирования в первичных лимфоцитах человека путем активного транспорта донорной ДНК и Cas9 в ядро

Руководитель Круглова Наталья Андреевна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук , г Москва

Конкурс №64 - Конкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-401 - Молекулярная и клеточная медицина

Ключевые слова геномное редактирование, CRISPR/Cas9, донорная ДНК, нокин, репарация по механизму гомологичной рекомбинации, пептидные ингибиторы слияния ВИЧ

Код ГРНТИ34.15.27

---

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

---

Аннотация
CRISPR/Cas9-опосредованное редактирование генома первичных гемопоэтических клеток человека по механизму гомологичной репарации (HDR) до недавнего времени считалось мало перспективным из-за низкой эффективности. Однако успехи в способах усиления HDR и аппаратной базы для доставки компонентов CRISPR приближают данное направление генной терапии к все более реальному. Ранее мы разработали CRISPR/Cas9 платформу для нокина коротких пептидов – ингибиторов слияния ВИЧ-1 c клеткой – и добились существенного прогресса в улучшении HDR в первичных CD4-лимфоцитах человека. Это стало возможным за счет удлинения плеч гомологии, клонирования ПЦР-донора в вектор и добавления в последний ряда сигналов, способствующих транспорту донора в ядро. Несмотря на это, разница по уровню нокина пептида в локус CXCR4 в опухолевой линии CEM и CD4-лимфоцитах остается огромной, около 35% и 4-5%, соответственно. Мы предположили, что повысить уровень нокина возможно, увеличив эффективность доставки беспромоторной донорной конструкции и Cas9 в ядро лимфоцитов. Для этого предлагается ввести в плазмиду с донорной конструкцией сайты связывания транскрипционных факторов, в частности, т. наз. SV40 DTS и сайты посадки NFκB. Было показано, что такие модификации существенно повышают транспорт плазмид в ядро, однако их вклад в усиление нокина, проведенного с помощью CRISPR/Cas9, неизвестен. Для улучшения ядерной доставки Cas9 в белок будут введены дополнительные сигналы NLS. Кроме того, мы оценим влияние молекулы полиглутаминовой кислоты и малых молекул – ингибиторов non-homologous end joining (NHEJ) – на уровень нокина в совокупности с оптимизированными донорными последовательностями и белка Cas9 с несколькими сигналами ядерной локализации (NLS). С помощью конфокальной микроскопии будет определена степень транслокации донора и Cas9 из цитоплазмы в ядро и проведена корреляция с уровнем нокина и нокаута в зависимости от введенных модификаций. Мы надеемся, что улучшенная доставка компонентов CRISPR в ядро позволит добиться дальнейшего усиления HDR в первичных клетках, что является необходимым шагом на пути к эффективной генной терапии.

---

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

---