Изучение роли ключевых аминокислотных остатков Fe(II/)2OG-зависимой диоксигеназы человека ALKBH3 в процессе каталитического деалкилирования поврежденной ДНК

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-24-00699

НазваниеИзучение роли ключевых аминокислотных остатков Fe(II/)2OG-зависимой диоксигеназы человека ALKBH3 в процессе каталитического деалкилирования поврежденной ДНК

Руководитель Канажевская Любовь Юрьевна, Кандидат химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук , Новосибирская обл

Конкурс №64 - Конкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые слова Метилирование ДНК, ДНК-диоксигеназы семейства AlkB, репарация ДНК, конформационная динамика, кинетика ферментативных реакций, флуоресцентные метки, FRET-анализ

Код ГРНТИ34.15.15, 31.27.15

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Алкилирование оснований ДНК агентами эндогенного и экзогенного происхождения оказывает цитотоксическое действие на клетку, а также может приводить к закреплению опасных мутаций в геномной ДНК. Репарация таких повреждений осуществляется с участием различных ферментов, главным образом, ДНК-гликозилаз, ДНК-метилтрансфераз и ДНК-диоксигеназ. В частности, Fe(II)/2-оксоглутарат-зависимые диоксигеназы из семейства AlkB катализируют прямое удаление алкильных групп с азотистых оснований ДНК и РНК. Гомологи диоксигеназы AlkB из E.coli широко представлены и у эукариот, при этом субстратная специфичность и их функции в клетке существенно отличаются. Некоторые из них участвуют в репарации геномной ДНК (ALKBH2), другие исправляют повреждения вблизи репликационных вилок (ALKBH3), третьи регулируют экспрессию генов, модифицируя тРНК и рибосомную ДНК (ALKBH5, ALKBH8), взаимодействуют с гистонами (ALKBH1). ДНК-диоксигеназы человека вызывают большой научный интерес ввиду их важной роли в процессах репликации и транскрипции, а также высокой вариабельности уровня их экспрессии при онкогенезе. Также была установлена взаимосвязь между активностью этих ферментов и устойчивостью некоторых опухолей к действию химиотерапевтических препаратов, что делает актуальной проблему создания безопасных и эффективных ингибиторов ДНК-диоксигеназ. Поскольку ДНК-диоксигеназы семейства AlkB играют важную роль в поддержании стабильности генома и жизнедеятельности клетки, то исследование структуры, функций и механизма катализируемой ими реакции является актуальной фундаментальной научной задачей. Человеческие гомологи бактериальной диоксигеназы AlkB, ферменты ALKBH2 и ALKBH3, имеют схожую организацию каталитического домена, при этом паттерны их субъядерной локализации и субстратная специфичность существенно отличаются. В настоящее время остается открытым вопрос, почему такие близкие по строению ферменты обладают такой широкой субстратной специфичностью. В литературе высказываются предположения об их эволюционном разобщении для участия в различных путях репарации ДНК. К настоящему времени рентгеновская структура комплекса диоксигеназы с поврежденной ДНК получена только для фермента ALKBH2, а структуру ALKBH3 удалось разрешить только в присутствии кофактора-металла и косубстрата 2-оксоглутарата и в отсутствие ДНК-субстрата. Это связано с подвижностью доменов белка, а также наличием в структуре слабо упорядоченных петлевых мотивов, которые играют важную роль в координации ДНК-субстрата. Окисление метильных групп с участием негемового железа представляет собой сложный многоступенчатый процесс, и для его понимания недостаточно данных о пространственной структуре диоксигеназ, полученных методом рентгено-структурного анализа. Очень важно установить детальный механизм узнавания ферментами поврежденной ДНК и ее последующего деалкилирования. В рамках настоящего проекта планируется детально исследовать роль отдельных ключевых аминокислотных остатков в ферментативном процессе, катализируемом ДНК-диоксигеназой ALKBH3. Для этого методом сайт-направленного мутагенеза будут получены соответствующие мутантные формы фермента. Будет охарактеризована их каталитическая активность в отношении модельных ДНК-субстратов, содержащих алкилированные основания. Для исследования влияния введенных замен на отдельные этапы каталитического цикла будет использован метод «остановленного потока» в сочетании с флуоресцентной спектроскопией. Этот метод предстационарной кинетики позволяет регистрировать конформационные переходы в реагирующих молекулах в миллисекундном диапазоне времени. В результате работы для каждого из изученных аминокислотных остатков будет установлена роль в молекулярно-кинетическом механизме узнавания, связывания и превращения поврежденной ДНК.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Канажевская Л.Ю., Коваль В.В. Влияние замены ключевых аминокислотных остатков на конформационную динамику Fe(II)/2OG-зависимой диоксигеназы ALKBH3 человека III ОБЪЕДИНЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ФОРУМ ФИЗИОЛОГОВ, БИОХИМИКОВ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ БИОЛОГОВ. НАУЧНЫЕ ТРУДЫ, НАУЧНЫЕ ТРУДЫ. Том 3. – М.: Издательство «Перо», 2022. – с.11 (год публикации - 2022)

2. Лукина М.В., Жданова П.В., Коваль В.В. Взаимодействие 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы человека с ДНК-дуплексами, содержащими oxoG-CLAMP напротив повреждения III ОБЪЕДИНЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ФОРУМ ФИЗИОЛОГОВ, БИОХИМИКОВ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ БИОЛОГОВ. НАУЧНЫЕ ТРУДЫ, НАУЧНЫЕ ТРУДЫ. Том 3. – М.: Издательство «Перо», 2022. – с.15 (год публикации - 2022)

3. Канажевская Л. Ю., Горбунов А.А., Жданова П.В., Коваль В.В. Dataset for Spectroscopic, Structural and Dynamic Analysis of Human Fe(II)/2OG-Dependent Dioxygenase ALKBH3 Data, 8, 57, 1-7 (год публикации - 2023)
10.3390/data8030057

4. Канажевская Л.Ю., Горбунов А.А., Лукина М.В., Смышляев Д.А., Жданова П.В., Ломзов А.А., Коваль В.В. The Role of Key Amino Acids of the Human Fe(II)/2OG-Dependent Dioxygenase ALKBH3 in Structural Dynamics and Repair Activity toward Methylated DNA Int. J. Mol. Sci., 25(2), 1145 (год публикации - 2024)
10.3390/ijms25021145

5. Канажевская Л.Ю., Коваль В.В. Структурно-динамические аспекты функционирования ДНК-диоксигеназ семейства AlkB Труды всероссийской научной конференции «Физико-химическая энзимология», Т1, стр. 20 (год публикации - 2023)

Публикации