Разработка олигонуклеотидных инсектицидов для защиты растений против насекомых-вредителей из подотряда Грудохоботные (отряд Полужесткокрылые) на основе коротких антисмысловых олигонуклеотидов рибосомальных генов

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-16-20052

НазваниеРазработка олигонуклеотидных инсектицидов для защиты растений против насекомых-вредителей из подотряда Грудохоботные (отряд Полужесткокрылые) на основе коротких антисмысловых олигонуклеотидов рибосомальных генов

Руководитель Оберемок Владимир Владимирович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского" , Республика Крым

Конкурс №66 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами» (региональный конкурс)

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки; 06-104 - Агробиотехнологии

Ключевые слова Грудохоботные, австралийский желобчатый червец, британская щитовка, бересклетовая щитовка, японская восковая ложнощитовка, мягкая ложнощитовка, лавровая листоблошка, мимозная листоблошка, ДНК-инсектициды, сельское хозяйство, лесное хозяйство, безопасные средства защиты растений, антисмысловые олигонуклеотиды, рибосомальные РНК, постгеномный подход в защите растений

Код ГРНТИ68.00.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Сегодня разработка безопасных препаратов для защиты растений на основе природных полимеров - нуклеиновых кислот - одна из перспективных и актуальных задач сельского и лесного хозяйства на фоне постоянного повышения спроса на продовольствие и сокращения посевных площадей. Научная новизна работы заключается в том, что разрабатываемые ДНК-препараты на основе антисмысловых олигонуклеотидов к 5,8S и 28S рибосомальной РНК насекомых-вредителей подотряда Грудохоботные способны объединить наилучшие качества современных химических и биологических инсектицидов: быстродействие, доступность, эффективность и избирательность. Такой подход был впервые успешно применён нами на непарном шелкопряде (Oberemok V.V. 2008. Ukrainian Patent Application No. 36445, Scientific Reports, №6197, Oberemok et al., 2019), бересклетовой щитовке, британской щитовке и японской восковой ложнощитовке (Journal of Plant Protection Research, 2020, 60(2), стр. 220–223, Gal’chinsky et al., 2020; Journal of Plant Protection Research, 2020, 60(4), стр. 406–409, Useinov et al., 2020). В рамках данного проекта впервые планируется усовершенствование разработанных ДНК-инсектицидов и применение их улучшенной формулы на австралийском желобчатом червеце, бересклетовой щитовке, британской щитовке, японской восковой ложнощитовке, мягкой ложнощитовке, лавровой листоблошке и мимозной листоблошке, основываясь на их 5,8S и 28S рибосомальной РНК с целью достижения 90-100% смертности целевого насекомого-вредителя. Нужно отметить, что 5,8S и 28S рибосомальные РНК играют одну из ключевых ролей в биосинтезе белка и их разрушение способно привести к гибели клеток и, как следствие, к гибели всего организма насекомого. Кроме этого, 5,8S и 28S рРНК составляют около 85–90% от общей клеточной РНК, что создаёт хорошие предпосылки для эффективного действия ДНК-препаратов на клеточном уровне. Также важным направлением исследований данного проекта на насекомых-вредителях подотряда Грудохоботные (отряда Полужесткокрылые) станет обнаружение максимально короткой длины ДНК-инсектицидов с целью снижения себестоимости препарата. Часто единственным эффективным методом борьбы с австралийским желобчатым червецом, бересклетовой щитовкой, британской щитовкой, японской восковой ложнощитовкой, мягкой ложнощитовкой, лавровой листоблошкой и мимозной листоблошкой как одних из важных вредителей сельского хозяйства на цитрусовых, значительных вредителей садово-паркового хозяйства и лесного хозяйства является применение химических инсектицидов. Но в свою очередь химические препараты обладают длительным периодом полураспада и низкой избирательностью. Большинство современных химических препаратов (неоникотиноиды, пиретроиды, органофосфаты и др.), используемых для уничтожения данных вредителей, наносят существенный вред окружающей среде. Однако многие современные химические средства оказываются неэффективными для представителей данного подотряда. Например, ацетамиприд эффективен против ложнощитовок, но не очень эффективен против щитовок и может применяться только путем опрыскивания повреждённой листвы растений, а не традиционно как системный инсектицид. Имидаклоприд эффективен против ложнощитовок, но неэффективен против червецов и большинства щитовок. Динотефуран эффективен против большинства представителей подотряда Грудохоботные, однако для каждого отдельного вредителя, по которому нет информации о его чувствительности к данному препарату, это необходимо проверять. Проблему универсальности подхода с сохранением избирательности действия препаратов могут решить ДНК-инсектициды, в которых необходимо будет менять только последовательности азотистых оснований для получения наиболее высокого инсектицидного эффекта, в каждом отдельном случае борьбы с насекомыми-вредителями. Результаты данной работы помогут обосновать фундаментальность и целесообразность применения природных полимеров - нуклеиновых кислот, используя антисмысловые ДНК-фрагменты в качестве агентов контроля численности насекомых-вредителей. Фундаментальная значимость результатов заключается в возможности разработки и применения против определённых насекомых-вредителей высокоизбирательных ДНК-инсектицидов вместо неизбирательных химических препаратов.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Оберемок В.В., Усеинов Р.Ж., Скороход О.А., Гальчинский Н.В., Новиков И.А., Макалиш Т.П., Яцкова Е.В., Шармагий А.К., Головкин И.О., Гниненко Ю.И., Пузанова Е.В., Андреева О.А., Алиева Е.Е., Экен Э., Лайкова К.В., Плугатарь Ю.В. Oligonucleotide Insecticides for Green Agriculture: Regulatory Role of Contact DNA in Plant–Insect Interactions International Journal of Molecular Sciences, Int. J. Mol. Sci. 2022, 23(24), 15681; https://doi.org/10.3390/ijms232415681 (год публикации - 2022)
10.3390/ijms232415681

2. Пузанова Е.В., Оберемок В.В. Инновационный олигонуклеотидный инсектицид Хрит-11 показывает высокую эффективность и избирательность действия на Macrosiphoniella sanborni Gillette Экосистемы (год публикации - 2022)

3. Новиков И. А., Яцкова Е.В., Шармагий А.К., Пузанова Е.В., Билык А.И., Оберемок В.В. Инновационный постгеномный подход в борьбе с лавровой листоблошкой Trioza alacris Flor. Экосистемы, Вып. № 31(61), – С. 163-167. (год публикации - 2022)

4. Оберемок В.В., Гальчинский Н.В., Усеинов Р.Ж., Новиков И.А., Пузанова Е.В., Филатов Р.И., Куаку, Н.Дж., Куаме, К.Ф., Кра, К.Д., Лайкова Е.В. Four Most Pathogenic Superfamilies of Insect Pests of Suborder Sternorrhyncha: Invisible Superplunderers of Plant Vitality Insects, 14(5), 462 (год публикации - 2023)
10.3390/insects14050462

5. Гальчинский Н.В., Яцкова Е.В., Новиков И.А., Усеинов Р.Ж., Куаку, Н.Дж., Куаме, К.Ф., Кра, К.Д., Шармагий А.К., Плугатарь Ю.В., Лайкова Е.В., Оберемок В.В. Icerya purchasi Maskell (Hemiptera: Monophlebidae) Control Using Low Carbon Footprint Oligonucleotide Insecticides International Journal of Molecular Sciences, 24(14), 11650 (год публикации - 2023)
10.3390/ijms241411650

6. Пузанова Е.В., Новиков И.А., Билык А.И., Шармагий А.К., Плугатарь Ю.В., Оберемок В.В. Perfect Complementarity Mechanism for Aphid Control: Oligonucleotide Insecticide Macsan-11 Selectively Causes High Mortality Rate for Macrosiphoniella sanborni Gillette International Journal of Molecular Sciences, 24(14), 11690 (год публикации - 2023)
10.3390/ijms241411690

7. Гальчинский Н.В., Яцкова Е.В., Новиков И.А., Шармагий А.К., Плугатарь Ю.В., Оберемок В.В. Mixed insect pest populations of Diaspididae species under control of oligonucleotide insecticides: 3′-end nucleotide matters Pesticide Biochemistry and Physiology, 200, 105838 (год публикации - 2024)
10.1016/j.pestbp.2024.105838

8. Гальчинский Н.В., Яцкова Е.В., Новиков И.А., Шармагий А.К., Плугатарь Ю.В., Оберемок В.В. Oligonucleotide insecticides with low carbon footprint for green plant protection XX International Plant Protection Congress., XX International Plant Protection Congress. Athens, 1-5 July 2024. – P. 282. (год публикации - 2024)

9. Оберемок В.В., Пузанова Е.В., Гальчинский Н.В. The 'genetic zipper' method offers a cost-effective solution for aphid control Frontiers in Insect Science, 4, 1467221 (год публикации - 2024)
10.3389/finsc.2024.1467221

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
1. Для оценки возможного негативного воздействия ДНК-инсектицида (ICER-11, 5′-ACACCGACGAC-3′) и контрольных ДНК-олигонуклеотидов (ICER-11-3′, 5′-ACACCGACGAG-3′; ICER-11-5′, 5′-TCACCGACGAC-3′; ICER-11-C6, 5′-ACACCCACGAC-3′) на экспрессию важных для жизни растений генов была исследована экспрессия гена, кодирующего фермент риболузобифосфаткарбоксилазу/оксигеназу (РуБисКО) в P. tobira на 3-и сутки после обработки ДНК-олигонуклеотидами. РуБисКО составляет около 30 % всего белка растений и является самым распространённым ферментом на планете, катализирующим в фотосинтезе включение диоксида углерода в биологический круговорот, а также участвующий в фотодыхании. ICER-11 вызвал в 3,4 ± 2,6 раз более высокую экспрессию данного гена по сравнению с контролем. Однако она оказалась недостоверной (p>0,05). Сходная тенденция была получена и для ICER-11-3′ (в 1,9 ± 0,3); ICER-11-5′ (в 1,4 ± 1,2); ICER-11-C6 (в 5,1 ± 5,6). 2. Исследования показали высокое прогрессирующее снижение концентрации олигонуклеотидных инсектицидов под действием дезоксирибонуклеаз (ДНКаз) гомогенатов тканей: британской щитовки, лавровой щитовки и лавра благородного; японской восковой ложнощитовки и падуба остролистного; австралийского желобчатого червеца и питтоспорума тобира. ДНК-фрагменты полностью деградировали за 24 часа, что свидетельствует о возможности быстрой биодеградации олигонуклеотидных инсектицидов в экосистеме после их действия; и еще быстрее, в течение 3 часов, ДНКазами хризантемовой тли. 3. Так как все биохимические реакции в растительной клетке зависят от оптимальных значений pH, то была выполнена поисковая работа по выявлению влияния на pH растений фрагментов ДНК (олинциды и контрольные олигонуклеотиды) длиной 11 нт, как кислоты, содержащей в составе 10 остатков фосфорной кислоты (сильной кислоты). В результате измерения pH листьев лавра благородного обработанных DB-11, DB-11-3′, DB-11-5′ и DB-11-C6 на 3-и, 7-е, 10-е и 14-е сутки составили 6,37, 5,89, 5,81 и 5,86; 6,66, 5,96, 5,81 и 5,77; 6,53, 6,02, 5,82 и 5,82; 6,48, 6,12, 5,94 и 5,66 против 6,47, 5,97, 5,86 и 5,77 в контроле; питтоспорума тобира обработанных ICER-11, ICER-11-3′, ICER-11-5′ и ICER-11-C6 на 3-и, 7-е, 10-е и 14-е сутки составили 6,38, 5,97, 5,71 и 5,67; 6,16, 5,87, 5,76 и 5,63; 6,08, 5,99, 5,74 и 5,71; 6,03, 5,9, 5,90 и 5,94 против 6,37, 5,94, 5,77 и 5,72 в контроле; бересклета обработанных UE-11 на 3-и, 7-е, 10-е и 14-е сутки составили 6,41, 6,29, 5,87 и 5,72 против 6,37, 6,34, 5,71 и 5,66 в контроле. Из представленных данных видно, что на 3-и, 7-е, 10-е и 14-е сутки не было зафиксировано достоверного различия в pH листьев растений из опытных и контрольных групп (p>0,05). 4. По итогам выполнения проекта написано 2 статьи в журналах из базы данных Scopus (Q1 и Q2): - https://doi.org/10.1016/j.pestbp.2024.105838. - https://doi.org/10.3389/finsc.2024.1467221. Издан учебник "Разработка ДНК-инсектицидов: современный подход" ISBN 978-5-6048770-2-9, в который вошли статьи, опубликованные при поддержке гранта РНФ № 22-16-20052. 5. В смешанных популяциях насекомых-вредителей D. britannicus и A. lauri результаты секвенирования показали, что особи A. lauri с последовательностью 5′-ATCGTTGGCAT-3′ в участке 28S рРНК составляли 80 % особей смешанных популяций, а 20 % популяции составляли особи D. britannicus с последовательностью 5′-ATCGTCGGTAT-3′. На основе этих знаний были созданы олигонуклеотидные инсектициды AL-11 (5′-ATGCCAACGAT-3′, против A. lauri) и DB-11 (5′-ATACCGACGAT-3′, против D. britannicus) с совершенной комплементарностью к каждой из последовательностей. Также были сделаны замены отдельных нуклеотидов в олигонуклеотидном инсектициде DB-11, чтобы понять, какой нуклеотид будет играть наиболее важную роль в инсектицидном эффекте. В этой связи было создано три последовательности с заменами отдельных нуклеотидов, трансверсии на 3′-конце – DB-11-3′ (T на A), 5′-конце – DB-11-5′ (A на T) и в середине последовательности – DB-11-C6 (6-е азотистое основание последовательности; G на C), соответственно. Каждая последовательность была синтезирована на ДНК-синтезаторе ASM800ET. На 14-е сутки эксперимента смертность в группах опыта увеличилась и достигла в контроле 3,77 %, в AL-11 98,19 %, в DB-11 – 64,66 %, в DB-11-5′ – 53,89 %, в DB-11-C6 40,68 %, в DB-11-3′ 35,74 % и 89,85 % в группе с тиаметоксамом. Замена азотистого основания в последовательности олинцида DB-11 на 5′-конце приводит к снижению его эффективности на 17 %, а на 3′-конце – на 45 %. Замена азотистого основания в 6-й позиции снизила эффективность на 37 %. На основе полученных результатов по смертности от примененных олигонуклеотидных инсектицидов было построено простое неравенство, описывающее, что комплементарность нуклеотида на 3′-конце к сайту целевой 28S рРНК была наиболее важной для выраженного инсектицидного эффекта (значимость нуклеотидов для инсектицидного эффекта: 5′< (6) < 3′). Таким образом, результаты демонстрируют, что при создании олигонуклеотидных инсектицидов важно обращать внимание на его последовательность на 3′-конце. В тоже самое время для S. pineti мы впервые показали, что неканоническое спаривание оснований G(олинцида):U(рРНК) между целевой пре-рРНК и олинцидом также хорошо «переносится» тлей и не мешает проявлению активности олигонуклеотидных инсектицидов. После обработки S. pineti олинцидом Schip-11 (5′-TGTGTTCGTTA-3′) в концентрации 200 нг/мкл смертность вредителя достигла 84,19 % на 4-е сутки соответственно (р < 0,05). В ходе выполнения гранта РНФ, впервые обнаружено, что олигонуклеотидные инсектициды действуют через механизм ДНК-сдерживания, который является основой действия олигонуклеотидных инсектицидов. Олигонуклеотидные инсектициды обеспечивают ДНК-программируемую защиту растений, используя метод «генетической застёжки-молнии» (целевая рРНК и олигонуклеотидный инсектицид сцепляются и напоминают механизм молнии (в одежде), выполняемый дуплексом гидовая ДНК-рРНК при участии РНКазы Н). Механизм ДНК-сдерживания состоит из 2 этапов: на первом этапе антисмысловой ДНК-олигонуклеотид (олигонуклеотидный инсектицид) комплементарно взаимодействует с целевой пре-РНК и/или рРНК (другими словами, «арестовывает» целевую пре-РНК и/или рРНК) и препятствует нормальному функционированию рибосом вызывая гиперкомпенсацию рРНК; на втором этапе РНКаза H расщепляет целевую пре-РНК и/или рРНК, и происходит существенное снижение ее концентрации. 6. Ссылки на информационные ресурсы в сети Интернет, посвященные проекту: - https://youtu.be/w28w91V4uCA?si=_B44gWW0rlfRtQ68 - https://crimea.mk.ru/amp/science/2024/09/08/v-krymu-sozdali-preparat-kotoryy-pomozhet-zashhitit-kofe-i-apelsiny-ot-vrediteley.html - https://crimea24tv.ru/content/prirodniy-preparat-protiv-vreditele/

Публикации

Возможность практического использования результатов
Сформировали коммерческое предложение по запросу «Зарядье» которое предполагает оказание услуг по проведению энтомоакарологического обследования на Объекте "Аэропонный комплекс "Флорариум". Кроме этого, данная услуга будет включать в себя: выявление доминирующих видов, разработку новейших олинцидов и олакцидов с последующим их применением на Объекте с подготовкой развернутого научно-исследовательского отчета по проведенным исследованиям.