Регуляция биосинтеза стильбенов и их применение для защиты сельскохозяйственных растений

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-16-00078

НазваниеРегуляция биосинтеза стильбенов и их применение для защиты сельскохозяйственных растений

Руководитель Киселев Константин Вадимович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Федеральный научный центр Биоразнообразия наземной биоты Восточной Азии» Дальневосточного отделения Российской академии наук , Приморский край

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки; 06-106 - Растениеводство

Ключевые слова Арабидопсис; виноград; генетическая трансформация; кальциевые сенсоры; пицеатаннол; пицеид; резвератрол; стильбены; стильбен синтазы; транскрипционные факторы; устойчивость растений; экспрессия генов

Код ГРНТИ62.09.37

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Стильбены – это относительно небольшая группа фенольных вторичных метаболитов растений, ключевым и наиболее известным среди которых является транс-резвератрол (транс-ресвератрол или т-резвератрол, 3,5,4′-тригидрокси-транс-стильбен). Резвератрол и другие стильбены синтезируются некоторыми таксономически отдаленными видами растений в качестве защитных соединений против патогенов и некоторых абиотических стрессов, например, от избыточного ультрафиолетового излучения. Резвератрол является ключевым соединением для синтеза остальных стильбенов, поскольку в результате олигомеризации, метилирования или гликозилирования резвератрола образуется видоспецифичный набор стильбенов (пицеид, виниферин, птеростильбен, пиносильвин и др.). Установлено, что т-резвератрол обладает широким спектром ценных биологически активных свойств и способен предупреждать возникновение и развитие онкологических и сердечно-сосудистых заболеваний, оказывает антиаллергическое действие, замедляет процессы старения. В настоящее время стильбены активно исследуются как перспективные составляющие лекарственных препаратов и используются как биологически активные добавки к пище, но не применяются в сельском хозяйстве. На наш взгляд, стильбены имеют большой потенциал для применения в сельском хозяйстве, поскольку действуют против многих патогенов сельскохозяйственных растений и в тоже время рекомендованы для употребления в пищу как вещества, оказывающее положительное влияние на сердечно-сосудистую систему. В современной литературе практически отсутствуют исследования, посвященные прямому применению стильбенов для защиты растений от патогенов и других стрессов, и недостаточно исследованы молекулярно-генетические механизмы регуляции биосинтеза стильбенов. В настоящее время многое остается неизвестным о сигнальных путях и транскрипционных факторах, регулирующих активность биосинтеза стильбенов растений. Кроме того, исследование растений-продуцентов стильбенов и разработка методик получения альтернативных источников этих ценных биологически активных веществ также остается высоко актуальной задачей. Таким образом, настоящий проект актуален и несет значительную научную новизну. Таким образом, с одной стороны важной задачей проекта является получение новых фундаментальных научных знаний о молекулярно-генетических механизмах и сигнальных путях, регулирующих биосинтез стильбенов. Например, получение новых данных о вовлеченности некоторых MYB R2R3 транскрипционных факторов, кальциевой сигнальной системы в целом и кальций-сенсорных белков в регуляцию биосинтеза стильбенов винограда, а также данных о специализации генов стильбен синтаз. На основе данных, полученных нами ранее и в настоящем проекте, планируется создание новых растений, культур клеток растений и микроорганизмов, являющихся активными продуцентами стильбенов и имеющих потенциал для применения в качестве альтернативных источников этих веществ. Кроме того, при выполнении проекта планируется продолжить изучение состава и спектра стильбенов у представителей флоры Дальнего Востока России, таких как горец Poligonum cuspidatum, лиственница Larix amurensis, сосна Pinus koraiensis., и тем самым увеличить список растительных источников этих веществ. С другой стороны, проект направлен на исследование возможностей прямого применения стильбенов для увеличения устойчивости растений к различным неблагоприятным условиям окружающей среды, в том числе к воздействию некоторых известных патогенных микроорганизмов и абиотических стрессов. Планируется это осуществить с помощью внешней обработки поверхности растений предшественниками стильбенов, чистыми препаратами индивидуальных стильбенов и стильбен-содержащими экстрактами дальневосточных растений, а также с помощью последующего анализа устойчивости обработанных растений к исследуемым стрессовым воздействиям. Известно, что флавоноиды, близкие вторичные метаболиты к стильбенам, способны выступать как регуляторы роста и развития растений (например, влияют на транспорт ауксинов), поэтому также необходимо изучить действие и стильбенов на рост и развитие растений и общий состав фитогормонов. Основные модельные объекты исследований в настоящем проекте – арабидопсис или ризуховидка Таля Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (который интересен как модельный объект) и некоторые сельскохозяйственные растения, выращиваемые в Приморском крае (в первую очередь виноград). В заключение, проект направлен на расширение теоретических знаний о возможностях регуляции биосинтеза стильбенов и посвящен поиску и созданию новых продуцентов стильбенов, а также получению практических знаний о применении стильбенов для улучшения устойчивости и продукционных характеристик растений.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Ананьев А.А., Супрун А.Р., Алейнова О.А., Нитяговский Н.Н., Огнева З.В., Дубровина А.С., Киселев К.В. Effect of VaMyb40 and VaMyb60 overexpression on stilbene biosynthesis in cell cultures of grapevine Vitis amurensis Rupr. Plants, 11, 1916 (год публикации - 2022)
10.3390/plants11151916

2. Киселев КВ, Алейнова ОА, Огнева ЗВ, Супрун АР, Ананьев АА, Нитяговский НН, Днепровская АА, Береш АА, Дубровина АС The effect of stress hormones, ultraviolet C, and stilbene precursors on expression of calcineurin B-like protein (CBL) and CBL-interacting protein kinase (CIPK) genes in cell cultures and leaves of Vitis amurensis Rupr. Plants, 12:1562 (год публикации - 2023)
10.3390/plants12071562

3. Киселев КВ, Огнева ЗВ, Алейнова ОА, Супрун АР, Ананьев АА, Нитяговский НН, Дубровина АС Influence of the 135 bp intron on stilbene synthase VaSTS11 transgene expression in cell cultures of grapevine and different plant generations of Arabidopsis thaliana Horticulturae, 9:513 (год публикации - 2023)
10.3390/horticulturae9040513

4. Супрун АР, Дубровина АС, Григорчук ВП, Киселев КВ Stilbene content and expression of stilbene synthase genes in korean pine Pinus koraiensis Siebold & Zucc. Forests, 14:1239 (год публикации - 2023)
10.3390/f14061239

5. Алейнова ОА, Киселев КВ, Супрун АР, Ананьев АА, Дубровина АС Involvement of the calmodulin-like protein gene VaCML92 in grapevine abiotic stress response and stilbene production International Journal of Molecular Sciences, 24:15827 (год публикации - 2023)
10.3390/ijms242115827

6. Киселев КВ, Алейнова ОА, Дубровина АС, Супрун АР, Огнева ЗВ The effect of external treatment of Arabidopsis thaliana with plant-derived stilbene compounds on plant resistance to abiotic stresses Тезисы докладов VII Международной научной конференции «Генетика, Геномика, Биоинформатика и Биотехнология растений», Казань, Республика Татарстан, Россия, 11-15 июля 2023 г., Т. 1, с.189 (год публикации - 2023)

7. Огнева ЗВ, Киселев КВ, Дубровина АС, Алейнова ОА, Супрун АР, Ананьев АА, Нитяговский НН Influence of the 135 bp intron on stilbene synthase VaSTS11 transgene expression in cell cultures of grapevine and different plant generations of Arabidopsis thaliana Тезисы докладов VII Международной научной конференции «Генетика, Геномика, Биоинформатика и Биотехнология растений», Казань, Республика Татарстан, Россия, 11-15 июля 2023 г., Т. 1, с. 289 (год публикации - 2023)

8. Алейнова О.А., Огнева З.В., Супрун А.Р., Ананьев А.А., Нитяговский Н.Н., Береш А.А., Дубровина А.С., Киселев К.В. The effect of external treatment of Arabidopsis thaliana with plant-derived stilbene compounds on plant resistance to abiotic stresses Plants, 13, 184 (год публикации - 2024)
10.3390/plants13020184

9. Алейнова ОА, Дубровина А.С., Супрун А.Р., Огнева З.В., Киселев К.В. Alternative splicing diversified abiotic stress response of VaCPK21 gene of wild-growing grapevine Vitis amurensis Plant Cell Tissue and Organ Culture, in press (год публикации - 2024)

10. Береш А.А., Трубецкая Е.В., Алейнова О.А., Огнева З.В., Супрун А.Р., Киселев К.В. Влияние внешней обработки стильбенами на устойчивость растений арабидопсиса Arabidopsis thaliana и томата Solnum lycopersicum к абиотическим стрессам тезисы 15-й Международной школы молодых ученых «Системная биология и биоинформатика» и 4-й Школы молодых ученых «Генетика, геномика, биоинформатика и биотехнология растений», 25-30 ноября 2024 г., Новосибирск, 1, 3 (год публикации - 2024)
10.18699/SBB-PlantGen-2024-03

11. Супрун АР, Киселев КВ, Алейнова ОА, Маняхин АЮ, Ананьев АА Analysis of phenolic compounds of Reynoutria sachalinensis and Reynoutria japonica growing in the Russian Far East Plants, 13, 3330 (год публикации - 2024)
10.3390/plants13233330

12. Нитяговский Н.Н., Алейнова О.А., Трубецкая Е.В., Киселев К.В. Транскриптомный анализ растений Arabidopsis thaliana после обработки стильбенами, кумаровой и салициловой кислотой тезисы 15-й Международной школы молодых ученых «Системная биология и биоинформатика» и 4-й Школы молодых ученых «Генетика, геномика, биоинформатика и биотехнология растений», 25-30 ноября 2024 г., Новосибирск, 1, 18 (год публикации - 2024)
10.18699/SBB-PlantGen-2024-17

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
1) Было независимо получено по 3 трансгенные линии клеток винограда V. amurensis, сверхэкспрессирующих полноразмерные гены VaMyb9 и VaMyb14. Ожидалось, что трансформация этими генами приведет к увеличению содержания стильбенов, потому что ранее было показано, что экспрессия этих генов увеличивалась в клетках с повышенным содержанием стильбенов. Однако достоверной активации содержания стильбенов в полученных клетках отмечено не было. 2) Был исследован состав фенольных соединений у рейноутрии японской Reynoutria japonica и сахалинской Reynoutria sachalinensis. В результате идентификации метаболитов в листьях, стебле и корнях мы выявили присутствие 31 соединения, включая 5 стильбенов: пицеатаннол, резвератролозид, транс-, цис-полидатин и транс-резвератрол. Показано, что корень R. japonica является богатым источником стильбенов (до 229 мг/г сухой массы корня), что в 8.5 раз выше, чем у корня R. sachalinensis (до 27 мг/г сухой массы корня). Основным стильбеном в корнях рейноутрии был транс-полидатин, гликозид резвератрола. Полученные результаты опубликованы в иностранном реферируемом издании из первого квартиля (Suprun et al., Plants, 2024). 3) Было показано, что внешняя обработка растений арабидопсиса Arabidopsis thaliana растворами стильбенов и предшественниками фенольных соединений оказывала сильное защитное действие от воздействия высоких температур. Дальнейшие исследования показали, что стильбены способны активировать защитные механизмы растений через увеличение экспрессии определенных защитных генов. По данным исследованиям была подготовлена публикация, которая была принята в 2024 году в печать в реферируемом издании из первого квартиля (Aleynova et al., Plants, 2024). 4) Показано, что обработка водными растворами стильбенов достоверно увеличивала устойчивость к высоким температурам растений томата Solanum lycopersicum, сорт Микро Том. Обработка стильбенами (пицеид и экстракт ели) привела к повышению устойчивости растений томата S. lycopersicum к условиям высокой температуры. Таким образом, экзогенные стильбены способны улучшить выживаемость сельскохозяйственных растений в условиях высокой температуры. 5) На арабидопсисе A. thaliana и винограде V. amurensis и V. vinifera исследованы защитные свойства внешней обработки стильбенами и предшественниками фенольных соединений против распространённых биотических стрессов: известных патогенов растений (болезнь серая гниль, вызванная Botrytis cinerea). Показано, что транс-резвератрол, экстракт ели и п-кумаровая кислота эффективно сдерживали развитие патогена B. cinerea, но только при высоких используемых концентрациях – 5-10 мМ. 6) Растения A. thaliana были обработаны растворами стильбенов, предшественником стильбенов и салициловой кислотой. Через 24 ч из растений была выделена РНК и отправлена на NGS по технологии Illumina для получения транскриптома. Полученные прочтения были выровнены на геном A. thaliana (TAIR10.1) с помощью STAR. Среди проанализированных групп генов наибольшее число изменившихся генов приходилось на гены ответа на абсцизовую, жасмоновую, салициловую кислоты и ауксин. Обработка т-резвератролом и т-пицеидом привела к изменению уровня транскрипции суммарно у 15 и 32 генов упомянутых выше категорий, п-кумаровой кислотой – 108, экстрактом ели – 183 и салициловой кислотой – 404. Таким образом, стильбены специфически действуют на экспрессию ряда важных регуляторных и структурных генов, хотя их действие слабее, чем у салициловой кислоты. Идет дальнейший анализ транскриптома и подготовка его для депонирования в Генбанк. 7) ВЭЖХ анализ показал наличие стильбенов в бактериях рода Gordonia, грибы рода Biscognioaexia, Didymella, Alternaria (t-резвератрол не более 0.5 мкг/мл). Изначально все эндофиты культивировались в среде PDA, затем переносились в более бедную среду RCC. Смена среды объясняется тем, что в опубликованных работах по эндофитам чаще всего использовали бедные среды. К сожалению, все вышеописанные модификации не увеличили биосинтез резвератрола. Более того, синтезы стильбенов значительно упали в процессе культивирования. Показано, что в отрыве от растения-хозяина биосинтез стильбенов в эндофитах значительно уменьшается, что говорит о необходимости совершенствования условий культивирования для промышленного производства стильбенов. 8) Проанализировано содержание метаболитов в нескольких пробах дрожжей Pichia pastoris дикого штамма X-33, содержащие различные плазмиды (на основе pGAPZa), с генами биосинтеза ключевого стильбена резвератрола (4Cl, STS). Клетки дрожжей культивировали на стандартных средах (YPDA, yeast peptone dextrose adenine) с добавлением предшественников фенольных соединений (п-кумаровая кислота). Было выделено и идентифицировано несколько десятков различных фенольных соединений, но среди них не было стильбенов. 9) Ранее проведено 2 скрещивания по поиску белков партеров для гена VaCPK20 (позитивный регулятор биосинтеза стильбенов) на новой библиотеке кДНК винограда V. amurensis (Clontech), содержащей около миллиона уникальных колоний дрожжей. Далее на полученных колониях был сделан анализ на предмет подтверждения истинных взаимодействий. Однако полученные колонии не прошли подтверждение на сверхселективных средах. Мы предположили, что использовали кДНК библиотеки винограда V. amurensis, полученные в контрольных условиях, поэтому нет партнеров для взаимодействия с VaCPK20 или их количество крайне низкое и они не попадают в плазмиды и штаммы для взаимодействия. Поэтому мы сейчас получаем скрещивание на новых библиотеках кДНК, полученных после обработки ультрафиолетом, который является известным индуктором биосинтеза стильбенов. 10) Мы решили исследовать участие альтернативного сплайсинга (AS) в регуляции биосинтеза вторичных метаболитов и устойчивости растений к абиотическим стрессам с использованием кальций-зависимой протеинкиназы винограда V. amurensis VaCPK21. Выбор данного гена обусловлен тем, что ранее было показано, что он транскрибируется в нескольких альтернативных формах, его сверхэкспрессия повышает устойчивость растений к засолению, а близкие к нему гены являются позитивными регуляторами биосинтеза стильбенов. Сверхэкспрессия всех транскриптов VaCPK21 не оказала существенного влияния на биосинтез стильбенов. Сверхэкспрессия коротких транскриптов VaCPK21s1 и VaCPK21s2 в культурах клеток винограда придала устойчивости к изучаемым стрессам, в то время как сверхэкспрессия транскрипта со вставкой интрона VaCPK21L1 показала устойчивость к солевому стрессу, а также новую устойчивость к осмотическому стрессу, вызванному маннитолом. Нами показано, что АS может приводить к потере свойств, характерных для исходной канонической формы (в случае VaCPK21s1 и VaCPK21s2) или появлению новых свойств (VaCPK21L1). Полученные результаты были приняты к публикации в реферируемом издании (Aleynova et al. Plant Cell, Tissue Organ Cult., in press).

Публикации

Возможность практического использования результатов
использование результатов для получения более устойчивых к различным стрессам сортов сельскохозяйственных ценных растений. Поиск продуктов питания с повышенным содержанием ценных стильбенов.