Разработка технологии регенеративной биомедицины дендритных клеток для эффективной иммунотерапии раковых заболеваний.

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-15-20063

НазваниеРазработка технологии регенеративной биомедицины дендритных клеток для эффективной иммунотерапии раковых заболеваний.

Руководитель Самохвалов Игорь Михайлович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского" , Республика Крым

Конкурс №66 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами» (региональный конкурс)

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-401 - Молекулярная и клеточная медицина

Ключевые слова иммунотерапия рака, регенеративная медицина, иммунная система, дендритные клетки, дендритно-клеточные вакцины, плюрипотентные стволовые клетки человека, клеточная дифференцировка, гемопоэз, клетки-прогениторы, проточная цитометрия, магнитная сортирвка клеток

Код ГРНТИ76.03.55

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
По мере развития современной медицины борьба с раком выходит не передний план. Рак является второй по частоте причиной смертности после сердечно-сосудистых заболеваний, однако, в связи со сложившейся традицией, его негативное влияние на морально-психологическое состояние общества безусловно занимает лидирующие позиции. В связи с этим, иммунотерапия рака вызывает все большую надежду и завоевывает все большее признание как новая и эффективная методология борьбы с раковыми заболеваниями. Вакцины дендритных клеток являются одним из наиболее перспективных и безопасных методов иммунотерапии онкологических заболеваний. В наиболее распространенном на сегодняшнй день виде, технология вакцины дендритных клеток состоит из выделения моноцитов крови, их дифференцировки в ДК, активации и нагрузки онкоантигенами с целью приобретения ими способности активации цитотоксических Т клеток, некотрых Т – хелперов, и клеток-натуральных киллеров (НК). В свою очередь, эти активированные Т и НК клетки осуществляют непосредственное уничтожение опухолевых клеток. Однако, применение таких моно-ДК (моноцитарных дендритных клеток) по доступным клиническим данным, несмотря на отличительную безопасность процедуры, приводило к заметным положительным изменениям только примерно в 15% случаев. Считается, что такая довольно низкая эффективность обусловлена: 1) иммунно-супрессорной активностью раковых клеток, особенно на поздних стадиях болезни; 2) сложностью выбора эффективных онкоантигенов для активации ДК; 3) ограниченная активность моно-ДК по кросс-презентации онкоантигенов. Кроме того, отмечается неудовлетворительная пролиферация и миграционная способность моно-ДК, а также низкий уровень активации ими цитотоксических лимфоцитов. Решением такой проблемы является использование конвенциональных ДК первого типа (кДК1, cDC1). Их содержание в крови и лимфатических узлах очень невелико, однако кДК1, в особенности их CD141+XCR1+ популяция, отличаются чрезвычайно эффективной кросс-презентацией антигенов, а также высокоинтенсивным синтезом и секрецией большого количества интерлейкинов IL-2 и IL-15, необходимых для пролиферации цитотоксических Т лимфоцитов, поляризации Т хелперов в гамма-интерферон-продуцирующие Th1 клетки, а также для активации НК клеток. Все вышеперечисленые лимфоциты могут напрямую уничтожать раковые клетки, и поэтому кДК1 является наиболее предпочтительным типом ДК для эффективной иммунотерапии раковых заболеваний. Индуцированные плюрипотентные (репрограммированные) стволовые клетки человека (чиПСК) являются потенциально оптимальным аутологичным источником для получения больших количеств CD141+XCR1+ кДК1. В предварительных экспериментах, мы уже разработали основную методику простой, высоковоспроизводимой, направленной и безопасной генерации гетерогенных ДК из чПСК. Данный проект направлен на дальнейшую разработку и оптимизацию надежной и простой методики получения кДК1 так, чтобы их можно было легко очистить с помощью MACS (magnetic activated cell sorting), который признан клинически совместимым методом обогащения клеточных популяций. В итоге, мы планируем разработать протокол для важного этапа новой эффективной технологии иммунотерапиии рака на основе подходов регенеративной биомедицины. Внедрение данной технологии будет следующим этапом нашей работы, который не входит в рамки данного проекта.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Реган О. В., Гуртовая А. К., Аблаева Р. Н., Агеева Е.С.,Самохвалов И.М. ГЕНЕРАЦИЯ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК ИЗ МОНОЦИТОВ КРОВИ В БЕЗСЫВОРОТОЧНОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ КРЫМСКИЙ ЖУРНАЛ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ, том 12, номер 4, стр. 65-69. (год публикации - 2022)

2. Самохвалов И.М., Ляховицкая А.В I. M. Samokhvalov and A. Liakhovitskaia. Hematopoietic Development of Human Pluripotent Stem Cells. Advances in Pluripotent Stem Cells. IntechOpen, Aug. 04, 2023. DOI: 10.5772/intechopen.112554. IntechOpen Books Advances in Pluripotent Stem Cells., глава в книге стр.1-22 (год публикации - 2023)
10.5772/intechopen.112554

3. Дандан Ли, Минглин Оу, Гуандон Дай, Пенг Жу, Чи Луо, Иепин Чен, Захир Шах, Игорь М. Самохвалов, Лианхон Йин, Гуопин Сун, Донг Тан, Йон Дай Genotypic Characterization of a Chinese Family with Osteogenesis Imperfecta and Generation of Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells Frontiers in Bioscience-Landmark, Front. Biosci. (Landmark Ed) 2023; 28(12): 336 (год публикации - 2023)
10.31083/j.fbl2812336

4. Самохвалов И.М., Малый К.Д., Агеева Е.С., Дегирменджи Э.Т., Гуртовая А.К., Аблаева Р.Н., Трофимов П.С., Кубышкин А.В. Activation of human pluripotent stem cell-derived dendritic cells by cancer cell co-culture Медицинский Вестник Северного Кавказа, Medical News of North Caucasus, Vol. 19, Iss. 2, pp. 163-168 (год публикации - 2024)
10.14300/mnnc.2024.19037

5. Филоненко Е.С., Жанг Б., Альберт Е., Шах З., Шу Я.. Пенг Л., Волчков П., Самохвалов И.М. Generation of thymus reconstituting T cell progenitors from human pluripotent stem cells Cell Reports Methods (год публикации - 2025)

6. Шах З., Ванг С., Улла Х., Ю Х., Филоненко Е.С., Реган О.В., Волчков П., Дай Е., Ю Дж., Самохвалов И.М. RUNX1 is a key inducer of human hematopoiesis controlling non-hematopoietic mesodermal development Stem Cells (год публикации - 2025)

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В 2024 году группой ученых Крымского Федерального Университета им. В. И. Вернадского был разработан новый метод генерации дендритных клеток (ДК) из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (иПСК), позволяющий обеспечивать поступательное развитие ДК и их практически полную активацию. Основной целью данной разработки являлось подавление развития фетального фенотипа у иПСК-ДК (ДК, полученных из иПСК) и придание этим клеткам характеристик ДК взрослого типа. Фетальность (а также неонатальность) ДК, полученных из иПСК, является ключевой проблемой на пути использования иПСК-ДК для иммунотерапии раковых заболеваний [Sashamitr et al., 2018; https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29358940/]. Фетальные ДК схожи с толерогенными ДК [Iberg and Hawiger, 2021; https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32015076/] и не могут индуцировать ни образование цитотоксических Т-лимфоцитов, ни активацию клеток-натуральных киллеров, то есть тех составляющих иммунной системы, которые непосредственно уничтожают раковые клетки в организме. Протокол был создан на основе метода безцитокиновой планарной гемопоэтической дифференцировки в безсывороточных условиях культуры [Philonenko et al., 2021; https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34342123/]. В этом методе генерируется значительное количество гемопоэтических прогениторов, способных развиваться в любые типы клеток крови. Сначала иПСК дифференцировали в гемопоэтические прогениторы в отсутствии цитокинов, а затем добавляли в культуру два ключевых цитокина, участвующих в индукции развития кДК: GM-CSF и IL-4 [Cabeza-Cabrerizo et al., 2021; https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33481643/]. В рамках проекта РНФ была значительно усовершенствована система дифференцировки иПСК с целью обеспечения развития и созревания иПСК-ДК. Для этого дифференцировку стимулировали с помощью FLT3L, который является ключевым цитокином, стимулирующим выживание, пролиферацию и развитие ДК [Karsunky et al., et al 2003; https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12874263/]. Также, на ранних этапах дифференцировки мы добавляли в среду SCF, который тоже участвует в развитии ДК [Santiago-Schwarz et al., 1995; https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8526147/]. SCF (50 нг/мл) добавляли с 8 по 12 день дифференцировки, в то время как FLT3L (100 нг/мл) добавляли в период с 12 по 16 день. Затем добавляли GM-CSF (100 нг/мл, с 16 дня по 22 день) , IL-4 (100 нг/мл, с 18 дня по 22 день), фактор некроза опухоли (TNFα, 100 нг/мл, с 20 дня по 28 день), интерлейкин 1 бета (IL-1β, 100 нг/мл, с 22 дня по 28 день), и в конце интерферон гамма (IFNγ, 50 нг/мл, с 26 дня по 28 день). Критическим фактором оказалось то, что добавление GM-CSF и IL-4 производили на гораздо более поздних стадиях дифференцировки (День 16 вместо Дня 8). Это позволило сохранить и «включить» поздние миелоидные прогениторы, которые теоретически могут развиваться в ДК взрослого типа, избегая вовлеченности в фетальную «волну». Однако развитие в ДК взрослого типа требует особой системы культивирования, которая была разработана в ходе работ по проекту РНФ в 2024 году. Известно, что мезенхимальные стромальные клетки (МСК) костного мозга секретируют широкий ряд цитокинов и поддерживают развитие гемопоэтических прогениторов [Majumdar et al., 2000; https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11177595/]. Поэтому для создания системы созревания иПСК-ДК были созданы две линии МСК на основе первичных клеток из стернальных биоптатов, взятых у двух пациентов. Затем ДК, полученные с помощью нового протокола, культивировали на монослое МСК. После 12-14 дней ко-культивирования, суспензионные ДК анализировали с помощью проточной цитометрии. Было установлено, что с помощью системы ко-культивации с МСК удалось добиться эффективной активации во фракции суспензионных ДК, что выразилось в их высоком уровне экспрессии HLA-DR, особенно у CD45high клеток. Активированные иПСК-ДК разделяются на две отдельные популяции - CD45high и CD45low. Уровень экспрессии CD45 и HLA-DR коррелировал с уровнем экспрессии CD172a, специфичного маркера кДК второго типа. В то же время, обе популяции экспрессировали XCR1, исключительный маркер кДК первого типа. Предполагается, что CD14-XCR1+CD45highCD172ahighHLA-DRhigh популяция представляет собой полностью активированные конвенциальные дендритные клетки второго типа (кДК2). Данный тип кДК обладает способностью активировать цитотоксические Т-лимфоциты [Segura; https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35187651/] для уничтожения раковых клеток. Кроме того, этот тип отличается высоким уровнем секреции интерлейкина 12 (IL-12). Однако, экспрессия XCR1 может свидетельствовать о том, что эта популяция представляет собой особый тип ДК, совмещающий свойства и кДК первого (кДК1) и второго типов. XCR1+CD45lowCD172alowHLA-DRlow по-видимому представляет собой незрелые предшественники плазмацитоидных ДК (пДК) с их характерным низким уровнем экспрессии CD45 [Hussein and Wang, 2024; https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38893237/]. Остаточный уровень экспрессии XCR1 говорит о том, что пДК имеют общих предшественников с кДК в системе дифференцировки иПСК. Иммуноферментный анализ показал высокий уровень секреции чIL-12 суспензионными активированными ДК в условиях ко-культивации с МСК костного мозга. Генерация пДК из иПСК означает, что наша технология является инновационной и не имеет мировых аналогов. Ряд экспериментов подтверждает присутствие пДК в нашей системе дифференцировки иПСК. Например, изучалась возможность активации ДК в суспензионной безсывороточной культуре в присутствии цитокинов, простагландина PGE2, а также LPS E. coli, добавленных в разных сочетаниях. В присутствии только GM-CSF и IL-4, без добавления PGE2, LPS и про-воспалительных цитокинов, ДК, отобранные на 20 день дифференцировки, демонстрировали значительную пролиферативную активность. Анализ транскрипции некоторых генов-маркеров ДК человека показал, что при культивировании иПСК-ДК в присутствии только цитокинов GM-CSF и IL-4 происходит значительная активация экспрессии гена PTCRA, который является исключительным маркером пДК в системе миелоидной дифференцировки. Более «поздние» ДК транскрибировали этот маркер на значительно более высоком уровне. Эти данные указывают на то, что наряду с другими типами ДК, генерируются и постепенно развиваются ранние пДК, обладающие пролиферативной способностью в присутствии только 2 цитокинов. В отсутствии IL-4 уровень экспрессии PTCRA сильно падал, и даже добавление простагландина E2, ряда про-воспалительных цитокинов и LPS E.coli не могли восстановить экспрессию этого гена. Похожий паттерн экспрессии также демонстрировали гены, участвующие в активации мобильности ДК, такие как CCL13, CCL17 (хемокины), и металлопротеиназа ММР12. Таким образом, в 2024 году была создана технология генерации функциональных ДК, которые могут быть применены для иммунотерапии рака.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Результаты проекта могут быть использованы для создания новой биомедицинской технологии для борьбы с раковыми заболеваниями. Предполагается создать новое поколение персонализированных дендритно-клеточных вакцин с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.