Изучение новых механизмов, влияющих на эффективность иммунотерапии у детей с острыми лейкозами.

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-15-00491

НазваниеИзучение новых механизмов, влияющих на эффективность иммунотерапии у детей с острыми лейкозами.

Руководитель Зубаровская Людмила Степановна, Доктор медицинских наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения Российской Федерации , г Санкт-Петербург

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-215 - Гематология

Ключевые слова Дети, острый лейкоз, аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток, инфузии донорских лимфоцитов, потеря HLA, иммунологическая реконституция

Код ГРНТИ76.29.33

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК) является потенциально излечивающим методом терапии для детей c острыми лейкозами. Тем не менее, рецидивы заболевания происходят в среднем у 30-40% пациентов в зависимости от диагноза и статуса на момент трансплантации. Рецидивы cоставляют основную причину летальности после ТГСК (Elena Vladimirovna Semenova, 2020), (Volkan Hazar, 2020). Для профилактики и терапии рецидивов после алло-ТГСК используют раннюю отмену иммуносупрессии, различные варианты химиотерапии, таргетной терапии, терапию моноклональными антителами, гипометилирующими агентами. Однако в большинстве случаев развивающиеся рецидивы становятся резистентны к стандартным методам терапии. В связи с этим необходимой опцией профилактики и терапии после алло-ТГСК является иммуноадоптивная терапия. Инфузии донорских лимфоцитов (ИДЛ) – наиболее доступный и простой метод иммуноадоптивной терапии пациентов с острыми лейкозами после алло-ТГСК. ИДЛ могут быть эффективны в качестве монотерапии для профилактики рецидива и в комбинации с другими противоопухолевыми агентами для терапии рецидива у пациентов с острыми лейкозами (Sarita Rani Jaiswal et al, 2016), (Christoph Schmid et al, 2019), (Z Jedlickova et al, 2016), (Thierry Guillaume et al, 2021), (L Xuan et al, 2018), (Peng Zhao et al, 2021). Успех алло-ТГСК и проводимой иммуноадоптивной терапии на ее основе зависит от степени проявления реакции «трансплантат против лейкоза» (РТПЛ), для осуществления которой необходима презентация опухолевых антигенов Т-лимфоцитам в контексте HLA-II класса и экспрессия HLA I класса клетками бластной популяции. В последние годы при рецидивах острых лейкозов после гаплоидентичной ТГСК описан феномен потери гетерозиготности по генам HLA I и II классов в лейкемической популяции (Paula Muñiz et al, 2021), (L Crucitt et al, 2015). Около 1/3 рецидивов после гапло-ТГСК могут происходить из-за ускользания опухоли от иммунного надзора путем потери гетерозиготности по генам HLA I и II классов (Paula Muñiz et al., 2021). Данные о вкладе данного механизма в развитие рецидива у детей с острыми лейкозами после алло-ТГСК отсутствуют. В клинике НИИ ДОГиТ им. Р.М. Горбачевой накоплен большой опыт проведения алло-ТГСК у детей с острыми лейкозами, в том числе от гаплоидентичного донора. При проведении данной работы, впервые будет определено значение потери гетерозиготности по генам HLA I и II классов у детей с рецидивами после алло-ТГСК и ИДЛ от различных доноров. Будут впервые определены факторы, ассоциированные с развитием данного феномена у детей с острыми лейкозами, и результаты терапии данного типа рецидива. Полученные данные помогут оптимизировать подходы к проведению алло-ТГСК. Данная методика позволит разработать индивидуальную стратегию терапии для каждого пациента. Вторая часть проекта будет направлена на проспективное изучение иммунной реконституции при проведении иммуноадоптивной терапии инфузиями донорских лимфоцитов. Раннее восстановление абсолютного числа и субпопуляций лимфоцитов, а таже NK клеток улучшают показатели общей выживаемости и снижают риск рецидива (Marcel R. Et al., 2015),( Norimichi Hattori et al, ,2018 ),(Lia Manculescu et. al, 2020), (Manuela Spadea et al., 2021), (Aline Risson Belinovski et al, 2020). Мы полагаем, что эффективность раннего введения ИДЛ зависит от кинетики иммунной реконституции. Мы планируем оценить субпопляционный состав лимфоцитов перед началом введений профилактических ИДЛ и его изменения во время введений. В дальнейшем будет выполнена оценка влияния восстановления субпопуляционного состава лимфоцитов на общую и безрецидивную выживаемость, частоту и тяжесть развития индуцированной РТПХ у детей после алло-ТГСК. По результатам исследования будут определены показания к проведению ранних введений ИДЛ. Таким образом, выполнение проекта подразумевает решение следующих задач: 1) Ретроспективный анализ потери гетерозиготности по генам HLA на бластной популяции у детей и подростков в возрасте от 0 до 21 лет с рецидивом острого лейкоза после алло-ТГСК. 2) Проспективный анализ потери гетерозиготности по генам HLA у детей, наблюдающихся в клинике НИИ ДОГиТ с подтвержденным костномозговым или комбинированным рецидивом после алло-ТГСК. 3) Выявление факторов риска, влияющих на развитие феномена потери гетерозиготности по генам HLA, и анализ результатов терапии данного типа рецидива. 4) Проспективный анализ динамики субпопуляционного состава T-лимфоцитов и NK-клеток у детей с острыми лейкозами при введении профилактических ИДЛ. 5) Выявление клинических факторов (возраст, диагноз, статус на момент ТГСК, режим кондиционирования, тип донора, , сроки отмены иммуносупрессивной терапии, индукция РТПХ) и лабораторных данных (изменения субпопуляционного состава T лимфоцитов и NK), улучшающих результаты терапии ИДЛ. Данное исследование позволит индивидуализировать подход к профилактике и терапии рецидивов острых лейкозов у детей. Конечной целью данного проекта станет улучшение показателей выживаемости и качества жизни детей с острыми лейкозами группы высокого риска.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Цветкова Л.А., Паина О.В., Рахманова Ж.З., Кожокарь П.В., Фролова А.С., Бабенко Е.В., Семенова Е.В., Кулагин А.Д., Зубаровская Л.С. Combined adoptive immunotherapy with Blinatumomab and donor lymphocyte infusions in children with relapsed/refractory B-ALL after allogeneic stem cells transplantation Cellular Therapy and Transplantation, 11(2), pp. 31-38 (год публикации - 2022)
10.18620/ctt-1866-8836-2022-11-2-31-38

2. Паина О.В., Цветкова Л.А., Рахманова Ж.З., Кожокарь П.В., Фролова А.С., Осипова А.А., Екушов К.А., Добровольская Е.Д., Гиндина Т.Л., Бархатов И.М., Семенова Е.В., Кулагин А.Д., Зубаровская Л.С. Immunotherapy of high-risk infant acute lymphoblastic leukemia using blinatumomab and infusion of donor lymphocytes Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии, Vol 21, No 4, 53-59 (год публикации - 2022)
10.24287/1726-1708-2022-21-4-53-59

Публикации

1. Цветкова Л.А., Евдокимов А.В., Бархатов И.М., Паина О.В., Епифановская О.С., Бабенко Е.В., Иванова Н.Е., Рахманова Ж.З., Кожокарь П.В., Фролова А.С., Осипова А.А., Рябенко С.В., Козлов Д.В., Гиндина Т.Л., Семенова Е.В., Кулагин А.Д., Зубаровская Л.С. Прогностическое значение потери гетерозиготности HLA после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток при развитии рецидива острого лейкоза у детей Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии, Vol. 22, № 2, 44-53 (год публикации - 2023)
10.24287/1726-1708-2023-22-2-44-53

2. Цветкова Л.А., Осипова А.А., Евдокимов А.В., Кожокарь П.В., Рахманова Ж.З., Бархатов И.М., Паина О.В., Епифановская О.С., Бабенко Е.В., Иванова Н.Е., Козлов Д.В., Гиндина Т.Л., Быкова Т.А., Семенова Е.В., Зубаровская Л.С. Успех повторной аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток со сменой донора при потере гетерозиготности HLA у пациента с ювенильным миеломоноцитарным лейкозом: анализ серии клинических случаев Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии, Vol. 22, № 3, 28‒35 (год публикации - 2023)
10.24287/1726-1708-2023-22-3-28-35

3. Чекалов А.М., Цветкова Л.А., Левковский Н.В., Рудакова Т.А., Кучер М.А., Синяев А.А., Кулагин А.Д. Конгресс EBMT-2023: краткий обзор Клеточная Терапия и Трансплантация, Vol. 12, No. 2, 57-68 (год публикации - 2023)
10.18620/ctt-1866-8836-2023-12-2-57-68

4. Цветкова Л.А.,Евдокимов А.В.,Бархатов И.М., Паина О.В.,Кожокарь П.В.,Фролова А.С., Рахманова Ж.З, Осипова А.А., Козлов Д.В.,Бабенко Е.В.,Епифановская О.С.,Семенова Е.В.,Моисеев И.С.,Кулагин А.Д., Зубаровская Л.С. LOSS OF HETEROZYGOSITY (LOH) IN THE HLA REGION IN PEDIATRIC PATIENTS WITH RELAPSE OF HEMATOLOGICAL MALIGNANCIES AFTER HAPLOIDENTICAL HSCT Bone Marrow Transplantation, Volume 58, Supplement 1, 347-348, P283 (год публикации - 2023)
10.1038/s41409-023-02056-7

5. Бархатов И.М., Цветкова Л.А., Евдокимов А.В., Иванова Н.Е., Епифановская О.С., Семенко Ю.Г., Смирнов Б.И., Кулагин А.Д., Зубаровская Л.С. Молекулярно-генетические методы оценки потери гетерозиготности HLA после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у детей с острыми лейкозами РОССИЙСКИЙ ЖУРНАЛ ДЕТСКОЙ ГЕМАТОЛОГИИ и ОНКОЛОГИИ, Том 4, Vol.10, 25-33 (год публикации - 2023)
10.21682/2311-1267-2023-10-4-25-33

6. Осипова А.А., Цветкова Л.А., Паина О.В., Кожокарь П.В., Рахманова Ж.З., Евдокимов А.В., Бархатов И.М., Смирнов Б.И., Слесарчук О.А., Быкова Т.А., Семенова Е.В., Кулагин А.Д., Зубаровская Л.С. Efficacy of hypomethylating therapy prior to allogeneic hematopoietic stem cell transplantation upon clinical outcomes in patients with juvenile myelomonocytic leukemia Клеточная Терапия и Трансплантация, Vol. 12, No. 4, 24-30 (год публикации - 2023)
10.18620/ctt-1866-8836-2023-12-4-24-30

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В 2024 году был продолжен проспективный анализ фенотипической экспрессии HLA I и II методом проточной цитометрии у детей с острыми лейкозами. Всего за отчетный период анализ был выполнен у 30 пациентов: 12 пациентов без проведения алло-ТГСК, 18 пациентов с рецидивом после алло-ТГСК. Без проведения алло-ТГСК снижение экспрессии/полная потеря HLA наблюдалось у 4/12 (33%) пациентов, после алло-ТГСК – у 8/18 пациентов (44%). Среди 8 пациентов со снижением или полной потерей фенотипической экспрессии HLA у 3 пациентов (38%) причиной стала HLA LoH. Таким образом, мы обнаружили взаимосвязь между HLA LoH и фенотипической потерей HLA и установили, что треть случаев фенотипической потери HLA была связана с HLA LoH. Остальные случаи предположительно связаны с эпигенетическими причинами, либо обусловлены другими мутациями. Также, у 2 пациентов с HLA LoH отмечали сохранную фенотипическую экспрессию HLA. Для усовершенствования методики определения HLA LoH мы разработали метод ПЦР, позволяющий определять варианты In-Del на 6 хромосоме у пациента до и после алло-ТГСК. Методика была применена у одного пациента с ранее выявленной HLA LoH и продемонстрировала аналогичный результат. Мы начали анализ уровня экспрессии генов HLA I, HLA II, NLRC5 и CIITA, в который вошли 17 проб здоровых доноров и 8 проб пациентов с рецидивом острого лейкоза после алло-ТГСК, 5 из которых имели подтвержденную HLA LoH, 4 имели полное отсутствие/снижение фенотипической экспрессии HLA. Во всех остальных случаях, включая случаи с потерей гаплотипа и потерей фенотипической экспрессии HLA, отмечали сохранную экспрессию генов HLA C, DRB1, NLRC5, CIITA. Таким образом, при потере гаплотипа экспрессия генов HLA остается сохранной, однако, фенотипическая потеря может быть обусловлена аномальной структурой экспрессируемого продукта, а также наличием других эпигенетических изменений. Мы начали изучение эпигенетических причин, вызывающих фенотипическую потерю HLA. В анализ метилирования промотора HLA II класса (CIITA) были включены 15 пациентов с рецидивом после алло-ТГСК. Важнейшим результатом работы отчетного периода стало обнаружение метилирования промотора HLA II класса (CIITA-PIV) у пациента с рецидивом Т-ОЛЛ после гапло-ТГСК. У пациента также отмечалось снижение экспрессии HLA-DR, DP, DQ на бластной популяции до 3,3%. HLA LoH методом STR выявлено не было. В связи с предполагаемой эпигенетической дисрегуляцией, пациенту было назначено лечение 2 курсами гипометилирующих препаратов. При последнем контакте у пациента сохраняется полная ремиссия с МОБ-отрицательным статусом в течение 2 месяцев после окончания терапии. Таким образом, выявлена взаимосвязь снижения экспрессии HLA II класса с метилированием промотора CIITA, что позволило определить эффективную тактику ведения рецидива виде назначения эпигенетической терапии. Данный клинический случай опубликован в 3м номере журнала Cellular Therapy and Transplantation, 2024. Для поиска других генетических причин потери HLA была разработана NGS панель. Список анализируемых маркеров включил основные гены метилирования, а также транскрипционные активаторы HLA: DNMT3A, ASXL1, IDH1, TET2, CIITA, EZH2, NLRC5, KMT2A, JAK2, IDH2, KDM6A. Ввиду небольшого числа образцов, подходящих по критериям для анализа, а также невозможностью детекции HLA генов в рамках представленной NGS-панели, было принято решение о выполнении полноэкзомного секвенирования. Для анализа были отобраны 7 образцов ДНК, выделенной из пунктата костного мозга пациентов с рецидивом после алло-ТГСК,у которых отмечалось снижение фенотипической экспрессии HLA и отсутствие HLA LOH. В образцах со сниженным уровнем донорского химеризма выявлены 5 миссенс-вариантов неясного клинического значения и одна stop gained мутация в гене RAD54L c.286C>T (p.Arg96*). Предпринята попытка определения количества белкового продукта СIITA, NLRC5, с помощью вестерн блоттинга в образцах со снижением/отсутствием экспрессии HLA и отсутствием HLA LOH. Результаты пилотного исследования позволили успешно идентифицировать белки β-actin и CIITA в образце клеточной линии К-562. Дальнейший анализ включил 4 пробы пациентов с рецидивом после гапло-ТГСК, снижением фенотипической эскпрессии HLA и отсутствием HLA LoH. В результате исследования, не удалось обнаружить белки CIITA и NLRC5Ab в клинических образцах. Кроме того, контрольный ген β-actin детектировался только в одном образце, что может свидетельствовать о значительной деградации белков в исследуемых образцах. Завершен проспективный анализ изменений субпопуляционного состава Т-лимфоцитов у детей с острыми лейкозами после алло-ТГСК. В 2024 году анализ субпопуляционного состава (CD3+, CD4+, CD8+ наивные, центральной памяти, эффекторной памяти, эффекторы) проведен на 96 образцах периферической крови, взятой у 48 пациентов. Для анализа были отобраны пациенты (n=18), которым был выполнен анализ субпопуляционного состава после первого профилактической ИДЛ. Была отобрана группа контроля (n=12): пациенты, не получившие профилактические ИДЛ и имевшие пробы с аналогичной медианой времени забора. Было выявлено значимое увеличение медианы числа субпопуляции CD4+ наивных Т-клеток в группе пациентов, получивших профилактическое введение, p=0.043. При парном анализе субпопуляционного состава до и после введения ИДЛ №1 выявлена динамика в виде значимого увеличения числа CD4+ наивных Т-клеток, p = 0.0046 (рис.15), а также менее значимого увеличения числа CD8+ наивных Т-клеток после введения ИДЛ, p = 0.055. Завершен анализ супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC, полиморфно-ядерные, моноцитарные, ранние), а также М2 макрофагов (CD163+CD206+). Всего было проанализировано 89 проб костного мозга: 59 проб в 2023 году, 30 проб в 2024 году. Проведен анализ уровня MDSC в раннем посттрансплантационном периоде в зависимости от развития клинически значимой острой РТПХ (n=13), рецидива (n=10) и летальности (n=8). Всего в анализ было взято 37 проб с медианой даты забора 30 дней (22-71). Мы обнаружили взаимосвязь популяции e- MDSC (ранние супрессорные клетки миелоидного происхождения) и рецидива заболевания, p=0.038. Анализ экспрессии ко-ингибирующих рецепторов на поверхности Т-клеток (PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3) после алло-ТГСК проведен на 103 образцах периферической крови от 30 пациентов. При сравнении абсолютных значений уровня экспрессии молекул контрольных точек было выявлено значимое увеличение числа Т-клеток (СD3+), экспрессирующих TIM3 в точке на Д+100 у пациентов, в последующем развивших рецидив после алло-ТГСК, p=0.017. ROC-анализ также показал высокую чувствительность (85%) и специфичность (66%), AUC=0.79, рисунок 15. Таким образом, экспрессия TIM3 может быть ассоциирована с истощенным Т-клеточным фенотипом у детей с острыми лейкозами и может рассматриваться в качестве фактора, определяющего риск рецидива после алло-ТГСК.

Публикации

1. Паина О.В., Цветкова Л.А., Рахманова Ж.З., Кожокарь П.В., Осипова А.А., Евдокимов А.В., Епифановская О.С., Гиндина Т.Л., Бархатов И.М., Семенова Е.В., Кулагин А.Д., Зубаровская Л.С. Inotuzumab ozogamicin as a bridging therapy to allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in children with refractory/ relapsed B-cell acute lymphoblastic leukemia Pediatric Hematology/Oncology and Immunopathology, Том 23, № 2 , страницы 60-70 (год публикации - 2024)
10.24287/1726-1708-2024-23-2-60-70

2. Цветкова Л.А, Евдокимов А.В., Бархатов И.М., Паина О.В., Епифановская О.С., Рахманова Ж.З., Кожокарь П.В., Осипова А.А., Бабенко Е.В., Иванова Н.Е., Зубаровская Л.С. Clinical case of T-ALL relapse in a child after allo-HSCT associated with decreased expression of HLA class II and hypermethylated CIITA-promoter Cellular Therapy and Transplantation , Vol. 13, No. 3, 38-43 (год публикации - 2024)
10.18620/ctt-1866-8836-2024-13-3-38-43

3. Левковский Н.В. , Цветкова Л.А., Паина О.В. , Евдокимов А.В., Бархатов И.М. , Епифановская О.С. , Бабенко Е.В. , Иванова Н.Е., Рахманова Ж.З., Кожокарь П.В., Осипова А.А., Гиндина Т.Л., Семенова Е.В., Кулагин А.Д., Зубаровская Л.С. Immunoadoptive effect of donor lymphocyte infusion-induced acute graft-versus-host disease in children with acute leukemia Pediatric Hematology/Oncology and Immunopathology, Vol. 23, № 4, 95‒106 (год публикации - 2024)
10.24287/1726-1708-2024-23-4-95-106

4. Кожокарь П.В. , Цветкова Л.А. , Евдокимов А.В., Бархатов И.М., Паина О.В., Епифановская О.С., Рахманова Ж.З. , Осипова А.А., Бабенко Е.В., Иванова Н.Е., Зубаровская Л.С. Results of therapy for relapse associated with the loss of HLA heterozygosity in children with acute leukemia РОССИЙСКИЙ ЖУРНАЛ ДЕТСКОЙ ГЕМАТОЛОГИИ и ОНКОЛОГИИ (год публикации - 2024)