Исследование механизмов формирования мембраноатакующего комплекса комплемента C5b-9 на поверхности эндотелиальных клеток при атипичном гемолитическом уремическом синдроме. Поиск прогностических признаков для оценки тяжести и рецидивов этого заболевания.

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-15-00409

НазваниеИсследование механизмов формирования мембраноатакующего комплекса комплемента C5b-9 на поверхности эндотелиальных клеток при атипичном гемолитическом уремическом синдроме. Поиск прогностических признаков для оценки тяжести и рецидивов этого заболевания.

Руководитель Авдонин Пётр Павлович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН , г Москва

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-212 - Педиатрия и неонатология

Ключевые слова Тромботические микроангиопатии, гемолитический уремический синдром, комплемент, эндотелиальные клетки, микроциркуляция, почки, артериолы, мультимеры фактора Виллебранда, макрофаги-моноциты, гиалиновые тромбы, врожденный иммунитет, С3-гломерулопатия, секвенирование нового поколения

Код ГРНТИ76.29.36

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
ГУС представляет собой серьезную терапевтическую проблему в педиатрии и детской нефрологии, являясь одной из ведущих причин острого повреждения почек (ОПП) у детей с потенциальной трансформацией в терминальную стадию хронической болезни почек (ХБП) в различные сроки от начала заболевания. Диагноз ГУС основывается на триаде симптомов: микроангиопатической гемолитической анемии, тромбоцитопении и ОПП. Указанные признаки являются составляющими клинико-морфологического синдрома – тромботической микроангиопатии (ТМА), характеризующейся окклюзионным поражением сосудов микроциркуляторного русла, возникшим вследствие повреждения эндотелия. У большинства детей (85-90%) диагностируется инфекционно-обусловленная циклическая форма ГУС (STEC-ГУС/типичный ГУС), развивающаяся вследствие повреждения эндотелия сосудов микроциркуляторного русла шига-токсином продуцирующимся штаммами энтерогеморрагической E.coli или S.disenteriae type1. Другая форма ТМА – атипичный ГУС является редкой рецидивирующей формой заболевания с прогрессирующим течением и неблагоприятным прогнозом, в основе которого лежит хроническая неконтролируемая активация альтернативного пути комплемента наследственной (мутации генов, кодирующие белки комплемента) или приобретённой природы (антитела к фактору Н), ведущая к развитию системной комплемент-опосредованной форме ТМА. Установлено, что для реализации аГУС необходимо взаимодействие генетических аномалий в системе комплемента с триггерными факторами внешней среды, провоцирующими дополнительную активацию комплемента у предрасположенных лиц. До настоящего времени специфические диагностические маркеры аГУС отсутствуют. Поэтому в настоящее время известно, что STEC-инфекция также может быть комплемент-активирующим состоянием при аГУС, что позволяет у ряда пациентов с диагностированным вначале типичным ГУС пересмотреть диагноз в пользу атипичной его формы через различный временной промежуток в каждом конкретном случае. Терапевтический подход к аГУС был радикально усовершенствован с открытием и внедрением в клиническую практику экулизумаба – гуманизированного моноклонального антитела к С5-фракции терминальной стадии каскада комплемента, предотвращающего его расщепление, ведущего к образованию провоспалительного С5а и протромботического С5b-9 компонентов (МАК), тем самым устраняя их патогенное действие. Несмотря на очевидный эффект экулизумаба, прогноз заболевания остается серьезным, а в ряде случаев и неблагоприятным, так как во многом определяется своевременностью диагностики заболевания, а также сроками инициации комплемент-ингибирующей терапии. Дисбаланс альтернативного пути комплемента в результате генетических мутаций признается главной причиной развития аГУС, однако в 40-50% случаев генетическая природа заболевания не подтверждается, что не исключает диагноза аГУС. Это во многом объясняется сложностью и многофакторностью системы комплемента, являющейся основной частью врожденной иммунной системы. Согласно последним исследованиям, стало известным, что помимо экспрессированных на поверхности клеток и плазменных регуляторов комплемента существует внутриклеточная система комплемента, локализованная в комплосомах – специализированных структурах, присутствующих в различных клетках, включая эндотелиальные. Косвенные данные свидетельствуют об участии внутриклеточной системы комплемента в формировании C5b-9 (МАК) на поверхности эндотелия при рецидиве аГУС. Таким образом исследование молекулярных механизмов патогенеза аГУС является крайне актуальным, что позволит не только своевременно диагностировать заболевание, но и определить тяжесть состояния и начало рецидива, влияющих на прогноз «почечной» и общей выживаемости. Задачей данного проекта является выявление механизмов активации внутриклеточной системы комплемента в эндотелиальных клетках (ЭК), а также определение её участие в формировании C5b-9 при контакте эндотелия с плазмой пациентов с aГУС и STEC-ГУС в экспериментах ex vivo. В соответствии с этим планируется исследование влияния нейроэндокринных факторов, факторов роста, цитокинов на активность внутриклеточной системы комплемента в ЭК. Будет определена роль рецепторов плазматической мембраны и сигнальных систем в экспонировании эндогенных факторов C3 и С5, образовании комплекса мембранной атаки – C5b-9. Также предполагается оценка влияния плазмы пациентов с аГУС на жизнеспособность ЭК по маркерам апоптоза и некроза в двух точках исследования – в период активных проявлений аГУС (дебют/рецидив) и ремиссии заболевания. Второй задачей проекта будет поиск прогностических критериев, определяющих риск развития аГУС у пациентов со STEC-инфекцией, но и вероятность рецидива ТМА после отмены терапии экулизумабом у пациентов с аГУС. В качестве потенциальных прогностических признаков будут рассматриваться: показатель формирования мембраноатакующего комплекса на поверхности ЭК, генетический профиль пациентов (или наличие мутаций генов, кодирующих белки комплемента) с помощью метода секвенирования нового поколения, а также определение антител к разным эпитопам факторов Н и I (complement inhibitory factor). Оптимальной стратегии мониторинга активности комплемента в развитии аГУС, в том числе у пациентов со STEC-инфекцией в продроме, а также в прогнозировании риска рецидива аГУС после отмены экулизумаба на данный момент не существует. Кроме того, механизмы активации внутриклеточной системы комплемента в ЭК в условиях взаимодействия с плазмой пациентов с aГУС до настоящего времени не изучались. Таким образом, планируемое исследование позволит расширить представления о патогенезе ГУС, повысить не только эффективность проводимой терапии и, но и расширить горизонты лечения аГУС с применением (или разработкой) новых лекарственных средств, модулирующих активность мембранных рецепторов и сигнальных систем, сопряженных с внутриклеточной системой комплемента.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Эмирова Х.М., Лупан И.Н., Пищальников А.Ю., Волянский А.М., Василькова Д.С., Глухова Л.В., Кудлай Д.А., Музуров А.Л., Орлова О.М., Авдонин П.В., Авдонин П.П., Шаталов П.А., Козина А.А. Комплексный подход к диагностике и тактика лечения атипичного гемолитико-уремического синдрома, ассоциированного с мутацией в гене CFH: клиническое наблюдение Педиатрия, Педиатрия, 2022, Том 6, стр.168-177. (год публикации - 2022)
10.24110/0031-403X-2022-101-6-168-177

Публикации

1. Блинова М. С. , Генералова Г. А. , Эмирова Х. М. , Попов Е. Г. , Цветаева Н. В. , Васильев С. А. , Авдонин П. П. CИСТЕМА КОМПЛЕМЕНТА КАК ОБЩЕЕ ЗВЕНО В ПАТОГЕНЕЗЕ ГЕМОЛИТИКО-УРЕМИЧЕСКОГО СИНДРОМА Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, T. 40, № 4, стр. 235-258 (год публикации - 2023)
10.31857/S0233475523040047

2. Эмирова Х.М., Орлова О.М., Чичуга Е.М., Музуров А.Л., Авдонин П.П., Авдонин П.В. A Moderate Decrease in ADAMTS13 Activity Correlates with the Severity of STEC-HUS Biomolecules, 2023 Nov 20;13(11):1671. (год публикации - 2023)
10.3390/biom13111671

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Проведен ретроспективный и проспективный анализ особенностей течения различных форм аГУС у 172 детей в зависимости от их генетического профиля с 01.2012г. по 02.2022г. Постановка диагноз аГУС проводилась следующим образом. При развитии микроангиопатической гемолитической анемии (МАГА), тромбоцитопениии и острого повреждения почек (ОПП) диагноз спорадической формы аГУС устанавливался после исключения иных форм тромботической микроангиопатии (ТМА), а при семейной форме заболевания также при отягощенном семейном анамнезе /при наличии аГУС по крайней мере у двух членов семьи. Приобретенная аутоиммунная форма (CFH-Ат-аГУС) диагностировалась после исключения других форм ТМА и определения иммуноглобулинов класса G (IgG) в сыворотке крови против фактора Н. Поиск мутаций в клинически значимой части генома человека (экзоме) проводился методом секвенирования нового поколения (NGS – next generation sequencing) и секвенирования по Сэнгеру по панели аГУС: CD46, CFB, CFH, CFHR1, CFHR2, CFHR3, CFHR4, CFHR5, CFI, DGKE, PIGA, THBD, C3, ADAMTS13, CAPG, C2, MMACHC, INF2, VTN. Аутоантитела против фактора H определяли методом иммуноферментного анализа (ELISA-VIDITEST anti-complement factor H, ODZ-166, производство VIDIA, Чехия, www.vidia.cz). Для определения АТ класса IgG против фактора Н сыворотку крови разводилась в 100 раз, результат измерения выражался в условных единицах в мл (AU/ml). За верхнюю границу нормы было принято значение 1500 AU/ml. 2.2.Результаты В российской когорте детей спорадическая форма аГУС диагностировалась в 96,9% случаев, семейная – в 3,1%, CFH-Ат-аГУС в 23,8%. Генетическая природа заболевания подтверждается в 53,4% случаев (77,1% – изолированные генетические варианты, 22,9% – комбинированные) Комбинированные генетические варианты включали гены CFH (n=12), С3 (n=7), ADAMTS13 (n=4), CD46 (n=3), CFHR4 (n=2), CFHR5 (n=2), CFHR3 (n=1), CFI (n=1) и CFB (n=1). В 92,9% случаев мутации были гетерозиготными, в 7,1% – гомозиготными: у 2 детей – мутации гена DGKE, у 1 ребенка – 2 мутации CFH и в одном случае – мутация ADAMTS13. Генетические варианты исследованных генов комплемента с нарушением функции, ассоциированные с аГУС, выявлены у 6 (8,6%) из 70 обследованных пациентов со спорадической / семейной формой аГУС. Все обнаруженные патогенные генетические варианты были гетерозиготными и в 2/3 случаев – изолированными. Варианты, возможно нарушающие функцию (вероятно патогенные мутации), диагностированы в 30 (42,8%) наблюдениях, из которых в 28 (93,3%) случаях определялось гетерозиготное носительство. Вероятно патогенные мутации С3 идентифицированы у 4 детей (изолированные – 3, комбинированные – 1) с одинаковыми генетическими вариантами в 2 случаях и у 4 детей с различными вариантами гена CFI (изолированные – 3, комбинированные – 1). В 4 случаях обнаруживалось изолированное гетерозиготное носительство ADAMTS13 с повторяющимися генотипами у 2 детей. В равных случаях (n=2) выявлялись изолированные варианты THBD, DGKE (гомозиготный генотип), CFНR5 и в единичных – мутации С5 и CFHR2. У 6 пациентов с мутациями генов, не связанных с системой комплемента (DGKE, ADAMTS13), имелись признаки прогрессирующей и рецидивирующей ТМА, что не исключало течение аГУС. У детей с CFH-Ат-аГУС (n=41) в 36 (87,8%) случаях обнаружены делеции CFHR1|CFHR3 (гомозиготных – 28, гетерозиготных – 8). В 5 наблюдениях, несмотря на высокий уровень антител к фактору Н, генетическая детерминанта заболевания не была установлена. Среди 36 пациентов с делеций CFHR1|CFHR3 в 7 случаях обнаружено их сочетание с генетическими вариантами с неизвестным клиническим значением (при гомозиготной делеции – у 6 детей, гетерозиготной – у 1 ребенка). Анализ особенностей течения заболевания у больных с разной формой аГУС и разным профилем мутаций показал, что генетический профиль пациентов не определяет тяжесть и исход аГУС, но является значимым фактором риска развития рецидивов. Прогноз и выживаемость пациентов с аГУС определяются тяжестью острого периода и своевременностью назначения комплемент-блокирующей терапии. https://doi.org/10.24110/0031-403X-2024-103-4-8-24 Проведено ретроспективное исследование системы «ADAMTS13–vWF–тромбоциты», в которое вошли 88 пациентов с установленным диагнозом COVID-19, отягощённым нарушением функции почек, 57 мужчин и 31 женщина в возрасте от 21 года до 83 лет (средний возраст 55,5 ± 15,7 лет). В результате проведенных исследований установлена роль показателей системы ADAMTS13/фВ/тромбоциты как предикторов летального исхода у больных COVID-19 с нарушенной функцией почек, находящихся на гемодиализе (ГД). В этой когорте больных смертность коррелирует с умеренным снижением активности ADAMTS13 и тромбоцитопенией. Анализ ROC-кривых для активности ADAMTS13 и количества тромбоцитов как предикторов смертности показал, что при значениях активности ADAMTS13 <79% и <53% отношение шансов (ОШ) для летального исхода у пациентов на ГД (n=58) составило 8,53 (95% ДИ 2,12-34.3; p=0,0025) и 27.6 (95% ДИ 3,11-245; p=0,0029), при количестве тромбоцитов <75х103/мкл ОШ было равно 10,9 (95% ДИ 3,00-39,2; р=0,0003). Вероятность летального исхода у больных, имевших острое поражение почек и находившихся на гемодиализе была ещё более высокой. У пациентов на ГД с острым поражением почек, развившимся на фоне хронической болезни почек (n=10) при активности ADAMTS13 <79% ОШ для летального исхода было равно 117 (95% ДИ 1.9-7960; p=0,023). Вероятность выживания у пациентов с COVID-19 на ГД через 35 дней после поступления в клинику при активности ADAMTS13 < 53% была в 3,22+0,92 (p<0.01) раза ниже, чем у пациентов с активностью ADAMTS13 >53%.

Публикации

1. Эмирова Х.М., Орлова О.М., Вахитов В.К., Чичуга Е.М., Зайцева О.В., Музуров А.Л., Макарова Т.П., Авдонин П.В., Авдонин П.П. Предикторы неблагоприятного прогноза атипичного гемолитико-уремического синдрома у детей Практическая медицина, 22, № 2, С. 64-71 (год публикации - 2024)
10.32000/2072-1757-2024-2-64-71

2. Авдонин П.П., Блинова М.С., Серкова А.А.,Комлева Л.А., Авдонин П.В. Immunity and Coagulation in COVID-19 MDPI, Int J Mol Sci . 2024;25(20):11267. (год публикации - 2024)
10.3390/ijms252011267.

3. Эмирова Х.М., Панкратенко Т.Е., Вахитов В.К., Орлова О.М., Чернышева О.О., Музуров А.Л., Кудлай Д.А., Зайцева О.В., Мстиславская С.А., Абасеева Т.Ю., Генералова Г.А., Шаталов П.А., Авдонин П.В., Авдонин П.П. КЛИНИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ТЕЧЕНИЯ И ИСХОДЫ АТИПИЧНОГО ГЕМОЛИТИКО-УРЕМИЧЕСКОГО СИНДРОМА, АССОЦИИРОВАННОГО С АНТИТЕЛАМИ К ФАКТОРУ Н Педиатрия им. Г.Н. Сперанского, 103, 1, 123–137. (год публикации - 2024)
10.24110/0031-403X-2024-103-1-123-137

4. Авдонин П.П., Блинова М.С., Генералова Г.А., Эмирова К.М., Авдонин П.В. The role of the complement system in the pathogenesis of infectious forms of hemolytic uremic syndrome biomolecules MDPI (год публикации - 2023)
10.3390/biom14010039

5. Иванова Е.С., Авдонин П.П., Котенко О.Н., Столяревич Е.С., Фролова Н.Ф., Блинова М.С., Попкова В.С., Е.Ю.Рыбакова Е.Ю., Гончаров Н.В., Авдонин П.В. Снижение активности ADAMTS13 и тромбоцитопения как предикторы неблагоприятного исхода у пациентов с COVID-19, находящихся на гемодиализе Нефрология и диализ (год публикации - 2024)

6. Эмирова Х.М., Красько О.В., Абасеева Т.Ю., Панкратенко Т.Е., Музуров А.Л., Вахитов В.К., Соболева М.К., Шавкин А.Л., Лупан И.Н., Альбот В.В., Леденко Л.А., Макарова Т.П., Кудлай Д.А., Зайцева О.В., Шумейко Н.К., Орлова О.М., Генералова Г.А., Мстиславская С.А., Попа А.В., Кварацхелия М.В., Широнина Н.В., Шаталов П.А., Авдонин П.В., Авдонин П.П. Генетически-фенотипический профиль детей с атипичным гемолитико-уремическим синдромом Педиатрия. Журнал им. Г.Н. Сперанского, 103, №4, 8-24 (год публикации - 2024)
10.24110/0031-403X-2024-103-4-8-24

Возможность практического использования результатов
Использованный нами в процессе исследований подход для изучения активности системы комплемента ex vivo показал свою эффективность и может найти своё применение как в фундаментальных исследованиях, так и для оценки тяжести аГУС и эффективности применяемой антикомплиментарной терапии.