Конструирование Cas9 и Cas12a вирусоподобных частиц для получения эффективного и контролируемого нокина пептидных ингибиторов слияния ВИЧ-1 в CD4-лимфоциты человека

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-15-00381

НазваниеКонструирование Cas9 и Cas12a вирусоподобных частиц для получения эффективного и контролируемого нокина пептидных ингибиторов слияния ВИЧ-1 в CD4-лимфоциты человека

Руководитель Шепелев Михаил Валентинович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук , г Москва

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-403 - Медицинская микробиология и вирусология

Ключевые слова CRISPR/Cas, вирусо-подобные частицы, средства доставки, нокин, ВИЧ, пептидные ингибиторы слияния

Код ГРНТИ76.03.41

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Ранее мы разработали новый способ генотерапии ВИЧ на основе нокина (KI) пептидных ингибиторов слияния MT-C34 и 2P23 в локус CXCR4 человека (Maslennikova et al., 2021). Было показано, что, по сравнению с классической лентивирусной (LV) доставкой, KI MT-C34 обеспечивает более высокую экспрессию пептида и лучше защищает первичные CD4-лимфоциты от ВИЧ-инфекции. Однако эффективность KI в 4-5% остается существенно ниже эффективности LV доставки. Кроме того, электропорация, использовавшаяся для доставки компонентов CRISPR/Cas9, вызывает гибель 20-50% лимфоцитов. На этом фоне привлекательным выглядит способ доставки Cas-рибонуклеопротеинового комплекса (RNP) с помощью вирусоподобных частиц (VLPs). Он не вызывает гибель клеток, эффективен при работе с первичными клетками человека и характеризуется сниженным числом off-target эффектов. К настоящему моменту разработано несколько систем на основе Cas9-VLPs: Nanoblades и подобные, где ретро- или лентивирусный Gag слит с Cas9 через сайт распознавания вирусной протеазой, NanoMedic, где включение Cas9 в VLPs индуцируется взаимодействием FKBP12-рапамицин-FRB и ряд других. Однако данные системы не были адаптированы для направленной гомологичной рекомбинации (HDR). Кроме того, в результате их тестирования мы обнаружили ряд существенных недостатков: высокие дозы частиц, требующиеся для эффективного редактирования, низкая экспрессия модифицированного Gag и недостаточная эффективность загрузки Cas9 гидовой РНК (gRNA) при сборке VLPs, что может быть связано с различиями в субклеточной локализации компонентов системы, цитоплазматической для Gag и ядерной для Cas9 и gRNA. Наш проект будет посвящен решению указанных проблем и созданию более эффективной и адаптированной для HDR системы Cas-VLPs. Для локализации gRNA в цитоплазме будет использовано два решения: 1) экспрессия с Pol II промотора и фланкирование gRNA последовательностями рибозимов. Однако вырезание gRNA рибозимами по некоторым литературным данным может быть недостаточно эффективным, поэтому 2) будет создан вектор для экспрессии Cas12a совместно с crRNA под промотором Pol II. В отличие от Cas9, нуклеаза Cas12a обладает также РНКазной активностью и способна сама вырезать crRNA из CRISPR-кассеты, причем очень эффективно. Для стабилизации РНК, кодирующей Cas12a, которая может разрушаться в ходе процессинга crRNA, будет использована последовательность Triplex. В целях привлечения Cas9 или Cas12a в цитоплазму, к месту сборки, будут созданы их модификации на основе фото-индуцируемого NLS или NES и тамоксифен-ERT2 регуляции. Наилучшие варианты нуклеазы и регуляторных модулей будут слиты с последовательностью FRB, как описано для NanoMedic, после чего будет оценена эффективность сборки Cas-VLPs. За счет использования RRE/Rev-опосредованного ядерного экспорта планируется улучшить экспрессию FKBP12-Gag, ответственного за связывание с Cas белком. Для адаптации Cas-VLPs под HDR донорная последовательность в плазмиде будет фланкирована полными или укороченными протоспейсерами, что позволит Cas-RNP комплексу временно связать и упаковать донорную ДНК. Кроме конструирования Cas-VLPs, проект будет включать оптимизацию экспрессии анти-ВИЧ-1 пептида 2P23 в контексте белка-носителя CD52 путем скрининга частично-рандомизированной пептидной библиотеки. На основе анти-MT-C34 мышиной гибридомы, будет создано гуманизированное цитолитическое антитело, которое позволит контролировать редактированные лимфоциты in vivo. Реализация проекта поможет вывести технологию CRISPR/Cas нокина пептидных ингибиторов слияния ВИЧ на уровень, позволяющий проводить доклинические и клинические испытания, и будет полезна в других областях геномного редактирования, где требуется, например, коррекция наследственных мутаций или конструирование CAR-лимфоцитов.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Мазуров Д.В., Круглова Н.А., Комков Д.С., Голубев Д.С. HIV-1 inhibitory peptide knock-in-out rates in primary human lymphocytes can be improved by choosing CRISPR/Cas9 delivery method and nuclear localization strategy Cold Spring Harbor Laboratory Press, Abstract book, CSHL, August 2022, p.87 (год публикации - 2022)

Публикации

1. Мазуров Д.В., Рамадан Л., Круглова Н.А. Packaging and Uncoating of CRISPR/Cas Ribonucleoproteins for Efficient Gene Editing with Viral and Non-Viral Extracellular Nanoparticles Viruses, 15, 3, 690 (год публикации - 2023)
10.3390/v15030690

2. Н.А. Круглова, С.Е. Боровикова СОЗДАНИЕ ВИРУСОПОДОБНЫХ ЧАСТИЦ С Cas12a ДЛЯ РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНОВ КОРЕЦЕПТОРОВ ВИЧ Гены и клетки, Том XVIII, приложение, с.22 (год публикации - 2023)

3. С.Е. Боровикова, Н.А. Круглова Конструирование и оптимизация библиотеки GPI-заякоренных пептидов для скрининга в вирусологических тестах Гены и клетки, Том XVIII, приложение, с.60 (год публикации - 2023)

4. Н.А. Круглова, Д.С. Комков, Д.В. Мазуров, М.В. Шепелев МОДУЛЬ RRE-REV НЕ ОКАЗЫВАЕТ ВЛИЯНИЯ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ УПАКОВКИ БЕЛКОВ CAS9 И GAG В ВИРУСОПОДОБНЫЕ ЧАСТИЦЫ СИСТЕМЫ NANOMEDIC Доклады Российской академии наук. Науки о жизни (год публикации - 2024)

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Вирусоподобные частицы (VLP) представляют собой перспективный способ доставки RNP, к преимуществам которого можно отнести низкую токсичность для клеток по сравнению с электропорацией RNP, отсутствие риска интеграции генетического материала, а также возможность нацеливания VLP на определенные клеточные популяции за счет псевдотипирования. Это все указывает на существенный потенциал применения VLP для разработки генно-терапевтических подходов к лечению ВИЧ-1. В 2024 году нами были получены и охарактеризованы VLP системы NanoMEDIC на основе нуклеазы AsCas12a. Эффективная упаковка AsCas12a в VLP была показана впервые. Предложен способ повышения редактирующей способности VLP за счет локализации crRNA в цитоплазме, основанный на способности AsCas12a процессировать Pol II транскрипты. Показано, что экспрессия crRNA под контролем CMV вместо U6 промотора повышает редактирующую способность AsCas12a-VLP для трех локусов Venus, CCR5 и CXCR4, а AsCas12a-VLP превосходят по своей редактирующей активности аналогичные VLP с SpCas9 независимо от того, под каким промотором экспрессируется crRNA/sgRNA. Кроме того, показана возможность мультиплексного редактирования с AsCas12a-VLP на модели нокаута CCR5 и CXCR4 в клетках CEM/CCR5 в условиях электропорации, а также при трансдукции VLP в клетках Jurkat для нокаута CXCR4. Продолжением работы по VLP стало сравнение различных типов сборки VLP.Получены три типа VLP (Cas-VLP, eVLP и NanoMEDIC с доменами упаковки Gag, Gag-3xNES и FRB, соответственно) с нуклеазами SpCas9 и AsCas12a. Подобраны оптимальные протоколы наработки VLP и трансдукции клеток-мишеней. Проведено сравнение трех типов VLP по редактированию локусов Venus и CCR5 в клетках 293 и локуса CXCR4 в клетках Jurkat. Для нуклеазы SpCas9 наиболее высокие уровни нокаута были достигнуты с помощью системы Gag-3xNES, а для нуклеазы AsCas12a – для системы NanoMEDIC. Это первый пример параллельного сравнения VLP типа NanoMEDIC и VLP, основанных на слиянии нуклеазы с Gag, а также первый пример сравнения VLP, несущих две различные нуклеазы. Для характеристики состава VLP впервые разработан и валидирован метод детекции уровня crRNA нуклеазы AsCas12a в VLP с помощью количественной ПЦР на модели crRNA, направленных на корецепторы ВИЧ-1 CCR5 и CXCR4. Показано, что уровень crRNA в VLP существенно выше при получении VLP с использованием плазмидной конструкции для экспрессии crRNA под контролем CMV промотора в составе Pol II-зависимого транскрипта по сравнению с экспрессией crRNA под контролем U6 промотора, что согласуется с результатами геномного редактирования. Параллельно с разработкой VLP была продолжена оптимизация последовательности анти-ВИЧ пептида 2Р23. Биоинформатический анализ результатов NGS позволил идентифицировать 10 кандидатных вариантов пептида 2P23 с предположительно улучшенными защитными свойствами, среди которых удалось выявить 5 новых вариантов пептидов с повышенной экспрессией на поверхности Т клеточной линии. Уровень экспрессии пептида #7 был в более чем 5 раз выше, чем у исходного пептида 2P23. Далее необходимо проведение инфекционных тестов для оценки защитных свойств идентифицированных пептидов. Кроме того, получен вариант пептида 2P23 с повышенной экспрессией и улучшенными защитными свойствами с помощью введения канонических сайтов N-гликозилирования, фланкирующих пептид. Мишенью для генотерапии ВИЧ-инфекции является локус CCR5. Нами были созданы инструменты для эффективного нокаута CCR5 в формате VLP и RNP. Используя RNP AsCas12a, было показано редактирование эндогенного CCR5 в первичных CD4+ T лимфоцитах человека на уровне около 20-30%. Максимальный уровень нокаута достигается при использовании AsCas12a VLP или электропорации AsCas12a RNP. Наконец, разработана технология нокина с использованием AAV в качестве средства доставки донорной ДНК и VLP для доставки RNP. Нокин был осуществлён в двух модельных локусах используя VLP с SpCas9 (TLR5 и CXRC4) и AsCas12a (CXCR4). В клетках Jurkat с помощью комбинации AAV и VLP нам удалось достичь 30% эффективности нокина и одновременно 90% нокаута CXCR4. Это один из первых примеров нокина с помощью комбинации VLP и AAV, который открывает перспективы разработки генотерапевтических подходов на основе VLP и AAV.

Публикации

1. Круглова Н.А., Шепелев М.В. Increasing Gene Editing Efficiency via CRISPR/Cas9- or Cas12a-Mediated Knock-In in Primary Human T Cells Biomedicines, 12(1), 119; (год публикации - 2024)
https://doi.org/10.3390/biomedicines12010119

2. Калиниченко С.В., Рамадан Л., Круглова Н.А., Балагуров К.И., Лукашина М.И., Мазуров Д.В., Шепелев М.В. A New Chimeric Antibody against the HIV-1 Fusion Inhibitory Peptide MT-C34 with a High Affinity and Fc-Mediated Cellular Cytotoxicity Biology, 13(9), 675; (год публикации - 2024)
https://doi.org/10.3390/biology13090675

3. Боровикова С.Е., Шепелев М.В., Мазуров Д.В., Круглова Н.А. Efficient Genome Editing Using ‘NanoMEDIC’ AsCas12a-VLPs Produced with Pol II-Transcribed crRNA International Journal of Molecular Sciences, 25, 12768. (год публикации - 2024)
https://doi.org/10.3390/ijms252312768

4. Боровикова С.Е., Круглова Н.А., Тюкачева Е.А., Лужин А.В., Ульянов С.В., Мазуров Д.В., Шепелев М.В. Конструирование и оптимизация библиотеки GPI-заякоренных пептидов для скрининга в вирусологических тестах Материалы VI Национального конгресса по регенеративной медицине [электронный ресурс]; Санкт-Петербург, 13–15 ноября 2024 г. Санкт-Петербург: Эко-Вектор, 2024. 1157 c., Материалы VI Национального конгресса по регенеративной медицине [электронный ресурс]; Санкт-Петербург,13–15 ноября 2024 г. Санкт-Петербург: Эко-Вектор, 2024. 1157 c. DOI: https://doi.org/10.17816/morph.konf2024 (год публикации - 2024)
https://doi.org/10.17816/morph.konf2024

Возможность практического использования результатов
Результаты проекта имеют хорошие перспективы практического использования для оптимизации существующих и разработки новых способов генотерапии ВИЧ-1 инфекции, а также формируют научный и технологический задел в области создания инструментов геномного редактирования с помощью VLP.