КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер проекта 22-15-00149
НазваниеИзучение роли вирусов и бактериофагов в развитии кишечного дисбиоза и антибиотикорезистентности бактерий при инфекционных колитах у онкологических пациентов
Руководитель Чухловин Алексей Борисович, Доктор медицинских наук
Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения Российской Федерации , г Санкт-Петербург
Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»
Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-231 - Инфекционные заболевания
Ключевые слова кишечные инфекции, трансплантация, иммунные осложнения, кишечная микробиота, бактерии, вирусы, антибиотикорезистентность, бактериофаги, секвенирование ДНК, ген 16S рРНК, метагеномное секвенирование ДНК
Код ГРНТИ76.00.00
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Микробиота кишечника (совокупность множества видов бактерий, грибов и вирусов) представляет собой динамичную биологическую систему, необходимую для существования и роста организма. Состав и соотношение бактериальных популяций кишечной микробиоты резко нарушаются при тяжелых колитах, особенно при развитии антибиотикорезистентных бактериальных штаммов. В отличие от хорошо изученного бактериального компонента микробиоты (общий полиморфный ген 16S рРНК), вирусная популяции кишечной микробиоты (в частности – различные семейства бактериофагов) при тяжелых кишечных синдромах исследованы в значительно меньшей степени, ввиду отсутствия общего гена для вирусной популяции, пригодного для сравнительного молекулярно-генетического анализа. Цель проекта состоит в комплексной оценке количественных соотношений вирусной и бактериальной микробиоты кишечника методами метагеномики в образцах биоматериала от онкологических больных после массивной химио- и антибиотикотерапии для разработки диагностических маркеров и возможных средств коррекции дисбиоза кишечника. В качестве объекта клинического исследования будут обследоваться пациенты с инфекционными осложнениями после аллогенной трансплантации гемопоэтических клеток. Кишечная микробиота будет исследована при резистентных колитах с инфекцией C.difficile и развитием антибиотикорезистентных штаммов K.pneumonia и др. при трансплантации фекальной микробиоты (ТФМ). Количественная и качественная оценка образцов кишечной микробиоты до ТФМ и после нее будет проводиться высокопроизводительными методиками секвенирования нового поколения (NGS) - по разнообразию генов 16S rDNA (бактериальные гены). Кроме того, метагеномный NGS-анализ, позволит оценить соотношение различных вирусов эукариотических клеток и, в особенности - бактериофагов. За период выполнения проекта (3 года) основной группой пациентов будут реципиенты трансплантации фекальной микробиоты (ТФМ) в соответствии с общепринятыми вышеизложенными клиническими показаниями. Всего будут обследованы 50 пациентов и лиц контрольной группы.
В результате выполнения проекта, с помощью методов классической бактериологии, мультиплексной ДНК-диагностики, секвенирования ДНК нового поколения (NGS) и метагеномного анализа совокупности кишечных вирусных геномов будут установлены характерные нарушения вирусного компонента микробиоты, их связь с колонизацией антибиотикорезистентными кишечными бактериями после интенсивной антибиотико- и химиотерапии больных с системными злокачественными новообразованиями. Будут разработаны оптимальные методы количественной ПЦР-диагностики конкретных классов кишечных бактерий и вирусов для серийной количественной оценки состояния кишечной микробиоты больных при рефрактерных колитах и намечены пути коррекции локальной микрофлоры посредством трансплантации нормальной микробиоты и/или фаготерапии. Практические результаты исследования будут способствовать разработке новых методов диагностики и терапии кишечных синдромов, профилактике антибиотикорезистентных инфекций.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Публикации
1.
Спиридонова А.А., Волкова А.Г., Чухловин А.Б., Моисеев И.С., Зубаровская Л.С., Кулагин А.Д.
Spectrum of bronchoalveolar bacterial microbiota following hematopoietic stem cell transplantation: age dependence and microbiota shifts.
Cellular Therapy and Transplantation, номер 2, том 11, стр. 45-53 (год публикации - 2022)
10.18620/ctt-1866-8836-2022-11-2-45-53
2.
Голощапов O.В., Швецов А.Н., Чухловин А.Б., Спиридонова А.А., Владовская М.Д., Зубаровская Л.С., Кулагин А.Д.
Incidence of Common Herpesviruses in Colonic Mucosal Biopsies Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation
Microorganisms, том 10, номер 2128 (год публикации - 2022)
10.3390/microorganisms10112128
3.
Городничев Р.Б., Корниенко М.А., Беспятых Д. А., Малахова М. В., Веселовский В. А. , Голощапов О. В. , Чухловин А. Б., Беспятых Ю. А. , Шитиков Е. А.
Выделение и характеристика бактериофагов Klebsiella pneumoniae, кодирующих полисахарид-деполимеразы с уникальной капсульной специфичностью
Медицина экстремальных ситуаций, том 24, номер 4, 2022 (год публикации - 2022)
10.47183/mes.2022.038
Публикации
1.
Чухловин А.Б., Дудурич В.В., Кусакин А.В., Полев Д.Е., Ермаченко Е.Д., Асеев М.В., Захаров Ю.А., Эйсмонт Ю.А., Данилов Л.Г., Глотов О.С.
Evaluation of Gut Microbiota in Healthy Persons and Type 1 Diabetes Mellitus Patients in North-Western Russia
Microorganisms, 2023, 11, 1813. (год публикации - 2023)
10.3390/microorganisms11071813
2.
Голощапов О.В., Кучер М.А., Эйсмонт Ю.А., Чухловин А.Б.
Origin and consequences of intestinal dysfunction following cytostatic chemotherapy and hematopoietic stem cell transplantation.
Cellular Therapy and Transplantation, номер 2, том 12, стр. 4-14 (год публикации - 2023)
10.18620/ctt-1866-8836-2023-12-2-4-14
3.
Голощапов О.В., Щукина О.Б., Кусакин А.В., Цай В.В., Калинин Р.С., Эйсмонт Ю.А., Глотов О.С., Чухловин А.Б.
Next-generation sequencing-based monitoring of intestinal bacteria and bacteriophages following fecal microbiota transplantation in inflammatory bowel diseases.
Pathogens, том 12, стр. 1438 (год публикации - 2023)
10.3390/pathogens12121438
4.
Голощапов О.В., Чухловин А.Б., Волков Н.П., Бейнарович А.В., Лепик К.В., Гавриленко А.Н., Полев Д.Е., Клементьева Р.В., Михайлова Н.Б., Моисеев И.С.
Fecal microbiota transplantation for treatment of inflammatory bowel lesions in lymphoma patients: effects on intestinal and blood microbiota
Cellular Therapy and Transplantation, номер 3, том 12, стр.36-43 (год публикации - 2023)
10.18620/ctt-1866-8836-2023-12-3-36-43
Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В отчетном периоде продолжалось комплексное клиническое и молекулярно-биологическое исследование кишечного дисбиоза у больных онкогематологического профиля после интенсивной химио- и антибиотикотерапии с последующей трансплантацией гемопоэтических клеток (ТГСК) и мониторингом микробиоты до 1 года. Изучали состав и динамику микробиоты у пациентов с кишечной реакцией «трансплантат против хозяина» (РТПХ) и болезнью Крона (группа сравнения) после трансплантации кишечной микробиоты (ТФМ) от здоровых доноров.
Для оценки состава микробиоты применяли стандартную клинико-бактериологическую диагностику. Исследования клинически актуальных бактерий в стуле пациентов и здоровых доноров проводили методами мультиплексной ПЦР (система Колонофлор). Секвенирование ДНК кишечной микробиоты проводили на платформе NGS (MiSeq, NextSeq) с праймерами для амплификации 16S рРНК. NGS-исследования вирусов микробиоты (в т.ч. - популяций бактериофагов) выполняли с промощью оригинальной панели вирус-специфических ДНК-зондов. Контроль качества прочтений NGS выполняли с помощью программного обеспечения FastQC (версия 0.11.9). После проведения деконтаминации in silico проводили статистическую оценку качества и классификацию микробного состава с помощью VSEARCH (версия v2.22.1). Таксономия видов микробиома определялась сгенерированными OTU с помощью базы данных Ribosomal Database Project (RDP) V16 с VSEARCH. Классификацию вирусов проводили с помощью поисковой системы Kaiju, которая использует базу данных пептидных последовательностей (NCBI RefSeq).
В 2024 г. комплексная оценка бактериома завершена для группы пациентов после интенсивной терапии и ТГСК. Через 20-60 сут. после ТГСК мы подтвердили сужение альфа-разнообразия бактериома, резкое снижение доли Firmicutes (Bacillota) и Actinobacteria (Actinomycetota) и ее постепенное восстановление к 2 мес. после ТГСК. Содержание другой доминантной популяции –Bacteroidota - не изменялись значимо в течение 90 дней после ТГСК. На этом фоне отмечается колонизация кишечника Грам-негативными бактериями, в особенности - Klebsiella pneumoniae. После ТГСК показана сильная связь между содержанием энтеробактерий в образцах и рядом генов устойчивости к антибиотикам (ARG), в частности, с содержанием генов ctx-M1, BLAtem, BLAshv и OXA-48, что подтверждено культуральными методами (тест-система ChromAgar).
В целях выявления клинически значимых популяций бактериофагов мы применяли ранее предложенную нами NGS-панель праймеров для анализа кишечного вирома. В отчетном периоде было продолжено параллельное изучение бактериома (ген16S рРНК) и сообщества фагов (фагеома) с применением данной панели праймеров на платформе NGS. В отчетном году продолжали исследование клинической эффективности переноса фекальной микробиоты (ТФМ) пациентам с иммунной РТПХ после ТГСК, а также при болезни Крона (всего- 27 случаев, по 3-4 срока взятия биоматериала), с целью коррекции кишечного дисбиоза. Пациенты получали донорскую микробиоту 2 дня перорально в виде капсул. NGS-исследования ДНК стула в сроки до 60 сут. после ТФМ выявили различные виды бактериофагов (Caudoviricetes). Цитомегаловирус и аденовирус встречались в единичных случаях при болезни Крона. Средняя встречаемость отдельных родов бактериофагов, в целом, не различалась между пациентами с РТПХ и болезнью Крона. Индексы альфа-разнообразия вирусов в группах РТПХ и болезни Крона были сходны, с одинаковой динамикой их роста до 60 сут. после ТФМ. Временная динамика фагеома при РТПХ после ТФМ различалась для отдельных родов бактериофагов. Так, отмечено раннее возрастание уровней Eganvirus и Tequatrovirus и, наоборот - существенное снижение содержания Lederbergvirus у пациентов после ТФМ, что может быть связано с различными видами бактерий-хозяев.
Общее распределение отдельных родов бактерий и вирусов по сериям биоматериала было различным. Наиболее многочисленные роды бактерий (частота >40%) группировались в конкретных сериях образцов, в том числе - строго анаэробные бактерии (Lachnospira, Blautia, Ruminococcus, и др.) и потенциально патогенные микробы (E.coli, Haemophylus и Klebsiella). Напротив, различные роды бактериофагов (Tequatrovirus, Carijivirus, Eganvirus, Lambdavirus, Brunovirus, Bievrevirus) показали значительную дисперсию по общей группе образцов.
В связи с этим, мы сгруппировали фаги по их бактериям-носителям: E.coli, Enterobacteria и Salmonella по сведениям из БД «NCBI Taxonomy Browser». Относительное содержание E.coli/Shigella и доля фагов, специфичных для E.coli, были значительно выше при РТПХ, чем при болезни Крона (до 15 сут. после ТФМ). Отмечен также ряд других значимых корреляций между клинически актуальными бактериями (Klebsiella, E.coli, Enterococci) и отдельными видами фагов в образцах микробиоты. Связь между общим содержанием умеренных фагов и их бактерий-носителей (Enterobacteria) вполне объяснима и говорит о валидности комплексного подхода к анализу бактериома и вирома кишечника.
Ранее мы определяли динамику микробиоты у пациентов разных возрастов. В связи с этим, мы оценивали микробиоту полости рта у пациента в возрасте 6 мес. с тяжелым мукозитом полости рта в ходе лечения нейробластомы. При выполнении аутологичной ТГСК пациенту вводили перорально ротовую жидкость его здоровой матери. При этом не отмечено тяжелого мукозита, на фоне снижении в слюне патогенных бактерий (стафилококки, микрококки), наряду с повышением доли стрептококков. Этот клинический эффект заслуживает дальнейшего изучения.
Одной из задач отчетного периода было сравнение эффективности вирусной NGS-панели и тотального метагеномного подхода при анализе спектра вирусов в пробах ДНК кишечной микробиоты. Параллельное исследование образцов ДНК с использованием двух методологий NGS показало, что существенно большее количество фагов энтеробактерий обнаруживается с помощью метагеномного анализа, но представленность отдельных родов вирусов невелика. Вирус-специфическая панель NGS выявляла, в основном, фаги, инфицирующие Escherichia, Salmonella, Enterobacter, Shigella и Yersinia,. Применение данной вирусной NGS-панели позволяет проводить сравнительные полуколичественные оценки содержания конкретных вирусов в сложных биоматериалах.
Для фаготерапии с 2022 по 2024 г. собрано 99 больничных штаммов K. Pneumonia и отобраны фаги, лизирующие эти штаммы. Коктейли активных фагов применили у пациентов, инфицированных резистентными штаммами K.pneumoniae. Исследование бактериома методом NGS выявило временное снижение содержания K.pneumoniae у всех пациентов после 3 сут. фаготерапии при отсутствии долгосрочного эффекта.
Публикации
1.
Голощапов О.В., Чухловин А.Б., Буг Д.С., Полев Д.Е., Косарев О.В., Клементьева Р.В., Измайлова Е.А., Казанцев И.В., Хаоипская М.С., Голощапова М.О., Юдинцева О.С., Бархатов И.М., Петухова Н.В., Зубаровская Л.С., Кулагин А.Д., Моисеев И.С.
Feasibility, and Advantages of Oral Microbiota Transplantation: The First Clinical Case.
J Pediatr Hematol Oncol, J Pediatr Hematol Oncol. 2024 ;46(6):287-296. (год публикации - 2024)
10.1097/MPH.0000000000002896
2.
Голощапов О.В., Чухловин А.Б., Полев Д.Е., Эйсмонт Ю.А., Буг Д.С., Кусакин А.В., Косарев О.В., Клементьева Р.В., Гостев В.В., Агеевец В.А., Волков Н.П., Ипатова А.С., Моисеев И.С., Спиридонова А.А., Сидоренко С.В., Кулагин А.Д.
Time-Dependent Shifts in Intestinal Bacteriome, Klebsiella Colonization and Incidence of Antibiotic-Resistance Genes after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation
Biomedicines, том 12, №7, с. 1566. (год публикации - 2024)
10.3390/biomedicines12071566
3.
Голощапов О.В., Чухловин А.Б., Кучер М.А.
Intensive care in oncohematology: role of damaged gut barrier and malnutrition in bacterial dysbiosis
Cellular Therapy and Transplantation, том 13, №3, с. 7-19 (год публикации - 2024)
10.18620/ctt-1866-8836-2024-13-3-7-19
4.
Городничев Р.Б. , Корниенко М.А., Беспятых Д.А., Малахова М.В., Кривуля А.О., Веселовский В.А., Беспятых Ю.А., Голощапов О.В., Черненькая Т.В., Шитиков Е.А.
Выделение и характеристика вирулентных бактериофагов против Klebsiella pneumoniae значимых капсульных типов.
Медицина экстремальных ситуаций, т.4, №25, стр. 146-153 (год публикации - 2023)
10.47183/mes.2023.060
Возможность практического использования результатов
Возможность практического использования результатов проекта состоит в разработке новых методов ускоренного восстановления кишечной микробиоты у онкологических пациентов после интенсивной цитостатической и антииинфекционной терапии. Заместительная терапия и элиминация антибиотикорезистентных бактерий будет проводиться путем переноса фекальной микробиоты или, в дальнейшем - при введении новых пробиотических бактериальных штаммов (Enterococci, Bacteroides fragilis, Faecalibacterium prausnitzii и др.). В социальном плане, внедрение микробной терапии дисбиозов направлено на снижение смертности и ограниченное применение антибиотиков при тяжелых кишечных синдромах