Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В отчетном году были продолжены исследования по поиску новых маркеров плоскоклеточного рака легкого (ПКРЛ). Для этой цели мы использовали как биоинформатические, так и экспериментальные подходы с применением современных методов клеточной и молекулярной биологии. Нами впервые разработан метод ex vivo, позволяющий охарактеризовать не только маркеры канцерогенеза легких, но и маркеры иммунных клеток микроокружения опухоли. Установлено, что при небольшом индексе TPS вероятность определения экспрессии PD-L1 лиганда в опухолевых клетках была выше при использовании ex vivo метода, чем при гистологическом анализе образцов немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), что критически важно для определения тактики послеоперационного лечения пациентов. Метод ex vivo не позволил выявить экспрессию AhR и его репрессора AhRR, а экспрессия CYP1A1 регистрировалась в цитоплазме около 10% опухолевых клеток. Макрофаги были наиболее многочисленными клетками иммунного ответа для многих образцов НМРЛ, при этом для курящих пациентов характерны макрофаги «курильщика табака». Для большинства исследованных образцов аденокарциномы количество выявленных клеток иммунного ответа в опухолевом микроокружении в целом было больше, чем для образцов ПКРЛ пациентов. С помощью биоинформатического анализа доступных данных был исследован новый механизм регуляции уровня hsa-mir-301a в опухолевых тканях ПКРЛ у курящих пациентов, экспрессия которой (согласно ранее полученным результатам) была существенно снижена. Выявлено 3 гена, участвующих в процессинге микроРНК (DGCR8, DICER1 и FUS), уровень экспрессии которых зависит от курения, которые могут вызывать снижение уровня экспрессии hsa-mir-301a. С помощью TargetScan идентифицирован ген-мишень has-mir-301a IRF1 (Interferon Regulatory Factor 1) , кодирующий фактор транскрипции. С использованием базы данных UALCAN, которая включает 503 случаев, установлено, что уровень мРНК IRF1 был снижен в опухолевых тканях ПКРЛ, при этом курение вызывает статистически значимое снижение уровня экспрессии его гена. Уровень экспрессии hsa-mir-301a был существенно повышен в образцах ПКРЛ, при этом наблюдалась статистически значимая отрицательная корреляция уровней IRF1 и hsa-mir-301a. Эти результаты были подтверждены экспериментально на клинических образцах ПКРЛ, и также показана отрицательная корреляция между уровнями мРНК hsa-mir-301a-3p и IRF1. Дальнейший биоинформатический анализ показал, что ген IRF1 в опухолевых клетках ПКРЛ ассоциирован с сигнальными путями иммунных клеток. Показана статистически значимая связь высокого уровня экспрессии IRF1 с лучшим ответом пациентов НМРЛ, получавших анти-PD1 иммунотерапию (р=0,023), при этом высокий уровень экспрессии IRF1 связан с более благоприятным прогнозом. Тогда IRF1 может быть новым дополнительным биомаркером для выбора иммунотерапии даже при низком уровне PD-L1. Продолжены исследования другого потенциального маркера ПКРЛ AhR-регулируемого белка – нейропилина (NRP1), потенциальной мишени для иммунотерапии. В эксперименте in vitro с использованием клеточной культуры ПКРЛ CALU-1 показано, что через 24 ч инкубации с 20 мкМ бензо(а)пиреном (БП) экспрессия NRP1 увеличилась в 1,4 раза в отсутствии α-нафтофлавона (ингибитора AhR) и в 1,6 раз в присутствии αНФ. Эти результаты свидетельствуют о том, что увеличение экспрессии NRP1 под действием высокой дозы БП не зависело от AhR, и, вероятно, связано с другими, пост-транскрипционными механизмами, что требует дальнейших исследований. Анализ онлайн сервисов TIMER (модуль DiffExp), TNMplot и UALCAN показал снижение мРНК NRP1 в опухолевых тканях ПКРЛ по сравнению с нормальной тканью легкого, для АКЛ достоверных различий выявлено не было. Далее, результаты показали, что ген NRP1 в опухолевых клетках ПКРЛ ассоциирован с сигнальными путями неоангиогенеза и воспалением. С использованием онлайн сервиса TIMER показана положительная корреляция между инфильтрацией иммунных клеток и экспрессией NRP1, а снижение уровня NRP1 в опухолевых клетках сопровождается уменьшением инфильтрации Т-клеток, особенно цитотоксичных CD8+ T-клеток. Показана статистически значимая связь высокого уровня экспрессии NRP1 с лучшим ответом пациентов с немелкоклеточным раком легкого, получавших анти-PD1 иммунотерапию. Тогда NRP1 может быть новым дополнительным биомаркером для выбора иммунотерапии для лечения пациентов с немелкоклеточным раком легкого при низком уровне PD-L1. Исследована экспрессия генов-мишеней AhR, связанных с курением при ПКРЛ: PLA2G6, TBC1D22A, LGR4, SLC4A3, TMEM189, PA2G4P4, DNAJB9, SLC16A14, EHD4, ZNRF1 в культуре клеток CALU-1, инкубированных с бензо(а)пиреном. Показано статистически значимое усиление экспрессии PA2G4P4 и SLC16A14 в клетках, обработанных БП, которая снижалась в присутствии α-нафтофлавона, ингибитора AhR. Эти результаты подтвердили AhR-зависимую активацию их экспрессии под действием БП. Экспрессия генов PLA2G6, PA2G4P4, TBC1D22A и LGR4 снижалась при длительной, (в течение 48 ч) инкубации, что может быть обусловлено значительным повышением экспрессии репрессора AhR – AHRR. Экспрессия этого гена была увеличена в 2,5 и в 2,8 раз в клетках CALU-1, обработанных 1 мкМ и 20 мкМ БП. В целом, исследование экспрессии AhR-регулируемых генов в клеточной культуре ПКРЛ показало, что острое воздействие БП приводит к AhR-зависимому повышению экспрессии ряда ассоциированных с курением генов. При увеличении дозы канцерогена наблюдается снижение экспрессии этих генов, сопровождающееся значительным усилением экспрессии репрессора AhR – AhRR. Таким образом, выявлены новые мишени ПКРЛ для диагностики и терапии. Разработанный нами метод ex vivo подтвердил высокую гетерогенность экспрессии опухолевыми клетками различных маркеров и состава клеток иммунного ответа, что указывает на важность использования персонализированного подхода к диагностике и лечению каждого пациента. Найдены новые маркеры ПКРЛ, такие как hsa-mir-301a и регулируемый данной микроРНК ген IRF1. Высокий уровень экспрессии IRF1 связан с более благоприятным прогнозом для пациентов, получающих анти-PD-1 иммунотерапию. Белок NRP1, экспрессия которого заметно снижена в опухолях ПКРЛ у курящих пациентов, может быть новым дополнительным биомаркером для выбора иммунотерапии для лечения пациентов с немелкоклеточным раком легкого при низком уровне PD-L1. Найден ряд новых генов PLA2G6, PA2G4P4, SLC16A14, экспрессия которых связана с курением пациентов с ПКРЛ.