Формирование нервной системы ганглионарного и ламеллярного типов: основные принципы и возможности регуляции со стороны ранних нейромедиаторов.

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-14-00375

НазваниеФормирование нервной системы ганглионарного и ламеллярного типов: основные принципы и возможности регуляции со стороны ранних нейромедиаторов.

Руководитель Воронежская Елена Евгеньевна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН , г Москва

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-101 - Зоология

Ключевые слова нейрогенез, молекулярные маркеры нейрогенных зон, иммунохимические маркеры дифференцированных нейронов, ганглии, нервное кольцо, радиальные нервные тяжи, Mollusca, Echinodermata

Код ГРНТИ34.15.49

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Вопрос о том, каким образом в процессе развития устанавливается определенная форма нервных структур, различающихся по конфигурации и сложности, остается одним из самых захватывающих и нерешенных в области нейробиологии развития. Какие механизмы лежат в основе спецификации нейрогенных зон в эктодерме зародыша? Каков набор сигналов, указывающих нейробласту траекторию миграции к его конечному месту, а отросткам нейронов пути прорастания к целям? Чем определяется трансмиттерный фенотип нервной клетки? От решения этих вопросов зависит как понимание механизмов возникновения патологий в эмбриогенезе, так и разработка подходов для поддержания жизненно важных ментальных функций с возрастом. Поэтому они никогда не теряют своей актуальности, совершенствуются лишь методы и подходы, позволяющие всё ближе подойти к пониманию базовых механизмов этих процессов. Накопленные молекулярно-генетические знания последних десятилетий выявили поразительное сходство в паттернах экспрессии специфических маркеров нейрональных предшественников, а также сигналов, участвующих в спецификации зон презумптивной нейроэктодермы, у позвоночных и беспозвоночных животных. Эти данные в очередной раз подтверждают высокую консервативность базовых механизмов нейрогенеза. В заявляемом проекте мы предполагаем раскрыть последовательность клеточных и молекулярных событий, происходящих при формировании нейрональных структур ганглионарного типа (на примере центральных ганглиев брюхоногого моллюска) и ламеллярного типа (на примере нервного кольца и радиальных нервных стволов голотурии). Несмотря на существенный прогресс в области исследования дифференцировки специфических групп нейронов, нет четкого понимания, из каких именно зон нейроэктодермы зародыша формируются дефинитивные нервные структуры у моллюсков и иглокожих, какие молекулярные маркеры экспрессируются в различных зонах нейроэктодермы и как они согласуются с распределением дифференцированных нейронов определенного типа. Мы планируем решить следующие задачи: (1) определить место и время закладки основных нейральных зачатков; (2) проследить паттерн экспрессии молекулярных маркеров нейрональных прогениторных клеток: медиальных моторных, промежуточных и периферических сенсорных нейронов; (3) соотнести формирование прогениторных зон с дифференцировкой нейронов определенного трансмиттерного фенотипа (моноаминергические, ацетилхолинергические). Особое внимание будет уделено формированию центральных ганглиев нервной системы у моллюсков, нервного кольца и радиальных нервных тяжей у иглокожих. Кроме картирования хода нормального нейрогенеза также будет проведено экспериментальное исследование влияния одного из ранних медиаторов – серотонина – на процессы миграции клеток-предшественников нейронов и навигации аксонов дифференцирующихся клеток в выбранных модельных организмах. Для решения поставленных задач будут объединены усилия двух ведущих групп, исследующих механизмы нейрогенеза большого прудовика Lymnaea stagnalis и органогенеза голотурии Eupentacta fraudatrix. Ранее участниками коллектива была показана ведущая роль периферических сенсорных нейронов в маркировании мест образования центральных нервных структур у моллюсков (Voronezhskaya, Croll, 2016), установлена роль серотонина в навигации отростков нейронов в процессе развития двустворчатых моллюсков (Yurchenko et al., 2019), исследован на морфологическом уровне нейрогенез центральных нервных структур голотурий (Mashanov et al., 2007; Dolmatov et al., 2016, 2018). В предлагаемом проекте мы будем использовать как классические морфологические и иммуногистохимические методы визуализации нейрональных структур (антитела против тубулина, 5-НТ, GABA, ТН, ChAT, VAChT, FMRFамида), так и выявление молекулярных нейрональных маркеров, таких как паннейрональные маркеры: elav, sox; специфические для апикальной и бластопоральной нейрогенных зон: six, pax, otp, trpv, fox, nkx, msx, dlx, coe; и маркер дифференцированных нейрональных структур syt. Было показано, что такая молекулярная идентичность консервативна для нейрогенных эктодермальных тканей Bilateria. Для поиска ортологов генетических маркеров будет использоваться имеющиеся у участников проекта базы транскриптомов выбранных видов. Для визуализации мРНК таргетных генов в тканях будет впервые применена усовершенствованная методика in situ гибридизации - Hybridization chain reaction (HCR). HCR позволяет проводить одновременное картирование нескольких целевых мРНК, при этом используется множественное, изотермическое, бесферментное молекулярное усиление сигнала, что особенно важно в случае исследования зародышей ранних стадий развития. Полученные результаты будут верифицироваться с помощью стандартной in situ гибридизации для одиночных генов. Такой интегрированный подход будет применен впервые для исследования нейрогенеза брюхоногих моллюсков и голотурий. Выполнение задач проекта позволит установить комплексную архитектуру нервных структур ганглионарного и ламеллярного типов у типичных представителей первично- и вторичноротых животных. Объединение полученных знаний с данными о пространственной разметке нервной трубки у позвоночных позволит сравнить механизмы, благодаря которым центральные нервные структуры принимают разные формы. Найденные сходства и различия в ключевых генах разметки нейроэктодермы позволят лучше понять общие закономерности нейроморфогенеза, выявить ключевые факторы, нарушение которых приводит к аномалиям формирования нервной системы, в том числе и при процессе замыкания нервной трубки у хордовых. .

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Е.Е. Воронежская Serotonin as a volume transmission signal in the “simple nervous system” of mollusks: From axonal guidance to behavioral orchestration Frontiers in Synaptic Neuroscience, Front. Synaptic Neurosci. 14:1024778. (год публикации - 2022)
10.3389/fnsyn.2022.1024778

2. Богомолов А.И., Краус Ю.А., Воронежская Е.Е. ВЛИЯНИЕ МАТЕРИНСКОГО СТРЕССА НА УСТОЙЧИВОСТЬ ЭМБРИОНАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ У БРЮХОНОГОГО МОЛЛЮСКА LYMNAEA STAGNALIS Онтогенез (год публикации - 2022)

Публикации

1. А.С. Гирич WntA and Wnt4 during the regeneration of internal organs in the holothurian Eupentacta fraudatrix Genesis, 2023;e23562 (год публикации - 2023)
10.1002/dvg.23562

2. А. И. Богомолов, Ю. А. Краус, Е. Е. Воронежская Instability of the Mother’s Environment Leads to Reduced Developmental Robustness in Lymnaea stagnalis (Mollusca: Gastropoda) Russian Journal of Developmental Biology, Vol. 54, No. 5, pp. 324–333 (год публикации - 2023)
10.1134/S1062360423050041

3. А.И. Куртова, А.С. Гирич, И.Ю. Долматов, Е.Е. Воронежская Larval and adult nervous system in sea cucumber Eupentacta fraudatrix (Holothuroidea, Dendrochirotida) with lecitotrophic larvae Invertebrate Zoology (год публикации - 2024)

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Исследование проводилось на эмбрионах брюхоногого моллюска Lymnaea stagnalis и личинках голотурии Eupentacta fraudatrix. Для анализа экспрессии мРНК пронейрогенных, пронейрональных и нейрональных транскрипционных факторов и нейрональных структур использовалась комбинация методов гибридизационной цепной реакции in situ (HCR-ISH), иммуноцитохимии, конфокальной микроскопии и анализа клеточной пролиферации. Для анализа внешней морфологии личинок использовался также метод сканирующей электронной микроскопии (SEM). Проводились эксперименты с активацией cWnt, ингибированием MAPK и повышением уровня внутриклеточного серотонина (5-НТ), действием 5-НТ и дофамина (ДА) на плавание личинок. Показано наличие как продукта транскрипции, так и трансляции гена LsSoxB1 в подавляющем большинстве клеток эмбриона L. stagnalis, вместе с тем отмечены редкие зоны с наличием только мРНК или только белка. Выявлена неожиданно длительная и широкая экспрессия мРНК пронейрогенного фактора LsSoxB1 от стадии гаструлы до вылупления. LsSoxB1 был выявлен в клетках эктодермы головы, ноги, висцерального комплекса, формирующихся ганглиях и сенсорных клетках. Напротив, нейрогенный фактор LsSoxB2 экспрессировался только в субэпителиальных слоях и формирующихся ганглиях в процессе метаморфоза. LsSoxB1 был обнаружен в толще головы, ноги и висцерального комплекса, что указывает на миграцию клеток из эктодермальных пронейрогенных зон в область формирования ганглиев. Нами была отработана методика содержания культивирования эмбрионов вне яйца, что позволило провести трейсинг клеток нейроэпителиальных зон в зоны формирования ганглиев на живом эмбрионе. Такие эксперименты были выполнены для зародыша брюхоногого моллюска впервые. Анализ распределения LsSoxB1+ зон в эктодерме позволил впервые определить локализацию нейрогенных областей для церебральных, педальных, висцеральных и буккальных ганглиев. Клеточная пролиферация равномерно распределялась по эктодерме, что подтверждает преимущественно миграционный характер формирования ганглиев у моллюсков. Модуляция сигнальных путей вызвала значительные аномалии морфогенеза, включая радиализацию строения и нарушение инвагинации, определяемых как морфологически, так и по экспрессии паттернинговых маркеров Brachyury и FoxA. Анализ формирования серотонинергической системы у E. fraudatrix показал наличие достаточно плотной, но рассеянной нервной сети в эпителии личинки, позитивной к антителам против 5-НТ. Такое строение существенно отличает личиночную нервную систему E. fraudatrix от нервной системы планктотрофных личинок голотурий и других иглокожих. Мы показали, что у личинок морского ежа наблюдается спонтанный полиморфизм в дифференцировке ДА, но не 5-HT нейронов. Выявлена позитивная корреляция между нахождением личинки в нижних частях столба воды и числом ДА нейронов. В зачатке взрослой нервной системы голотурии 5-НТ позитивных элементов не обнаружено. Показана ранняя сегрегация SoxC+ клеток, которые в процессе развития конденсируются в специфических эктодермальных зонах личинки, стенках архентерона и дне вестибулума. В последующем в SoxC+ областях обнаруживаются клетки, экспрессирующие мРНК пронейрогенных факторов: delta, ngn, elav, и нейрогенного фактора syt. Распределение клеток, экспрессирующих мРНК пронейрогенных и нейрогенных факторов указывает на активные миграторные процессы во время формирования нервного кольца и вентральных стволов центральной нервной системы у голотурии. Полученные данные дают основания предполагать большее сходство в механизмах формирования нервных систем ганглионарного и ламеллярного типов, чем мы изначально предполагали.

Публикации

1. Куртова А.И., А.С. Гирич А.С., Долматов И.Ю., Воронежская Е.Е. Divergence in developmental patterns of larval and adult nervous system in direct-developing holothuria Eupentacta fraudatrix suggests their independent evolution Invertebrate Zoology, 21(2): 119–139 (год публикации - 2024)
10.15298/invertzool.21.2.01

2. Киркина Е.Г., Богомолов А.И., Воронежская Е.Е., К.А. Макавеева К.А., Мизгирев И.В., Калуев А.В., В.Д. Плотникова В.Д., Н.Д. Шамаев Н.Д. Использование альтернативных тест-систем в доклинической практике НПО "Дом фармации", г. Санкт-Петербург (год публикации - 2025)

3. Обухова А.Л., Хабарова М.Ю., Семенова М.Н., Старунов В.В., Воронежская Е.Е., Ивашкин Е.Г. Spontaneous intersibling polymorphism in the development of dopaminergic neuroendocrine cells in sea urchin larvae: impacts on the expansion of marine benthic species Frontiers in Neuroscience, 18:1348999 (год публикации - 2024)
10.3389/fnins.2024.1348999

4. Куртова А.И., Финошин А.Д., Апарина М.С., Газизова Г.Р., Козлова О.С., Воронова С.Н., Шагимарданова Е.И., Ивашкин Е.Г., Воронежская Е.Е. Expanded expression of pro-neurogenic factor SoxB1 during larval development of gastropod Lymnaea stagnalis suggests preadaptation to prolonged neurogenesis in Mollusca Frontiers in Neuroscience, 18:1346610 (год публикации - 2024)
10.3389/fnins.2024.1346610

Возможность практического использования результатов
Разработанные нами методы и подходы экспериментальной работы с развивающимися эмбрионами и личинками беспозвоночных животных, имеют значительный потенциал для создания и усовершенствования технологий в различных областях науки и практики. Биомедицинские исследования: Предложенная нами система развития пресноводного моллюска большого прудовика предоставляет уникальные возможности для моделирования процессов эмбрионального развития в целостном развивающемся организме, включая исследование механизмов регуляции межклеточных контактов, морфогенеза и дифференцировки клеток. Это может быть использовано при разработке новых технологий клеточной и тканевой инженерии, включая быстрый и дешевый скрининг различных биологически активных веществ при исследованиях процессов развития и клеточной дифференцировки. Генетика и генная инженерия: Разработанный нами метод культивирования зародыша моллюска вне яйцевой оболочки создает возможность доступа к эмбрионам на ранних стадиях, что особенно важно для внедрения CRISPR/Cas9 и других технологий редактирования генома. До настоящего времени такие технологии не применялись к зародышам и личинкам пресноводных моллюсков. Возможность точного контроля за развитием открывает путь к созданию улучшенных генетических моделей, применяемых в сельском хозяйстве, экологии и медицине. Разработка экологически безопасных технологий: Полученные знания о тонких деталях, клеточных и молекулярных механизмах развития зародыша большого прудовика и личинки голотурии дают возможность тестировать влияние различных химических соединений и факторов окружающей среды на эмбриональное развитие. На основе полученных данных могут быть усовершенствованы технологии очистки воды, производства биологических пестицидов и экологически безопасных удобрений. Производственные технологии: Полученные нами данные о действии моноаминов на развитие и поведение личинок водных беспозвоночных могут быть интегрированы в процессы биоинженерии для разработки автоматизированных систем культивирования моллюсков, иглокожих, и других водных организмов. Это позволит снизить затраты на культивирование и повысить производительность в аквакультуре, производстве биомассы и создании биоактивных веществ. Образовательная сфера: В социальной сфере полученные нами данные способствуют разработке инновационных образовательных программ в области биологии и экологии. Возможность наблюдать полный цикл развития зародыша от первого деления зиготы до формирования ювенильного организма в реальном времени повышает эффективность учебных практикумов и научных экспериментов в школах и университетах, способствуя популяризации научного знания. Таким образом, разработанные нами методы и подходы работы с эмбрионами и личинками беспозвоночных животных выходят за рамки исключительно фундаментальной экспериментальной биологии, предоставляя базу для совершенствования существующих и создания новых технологий в широком ряде областей.