Разработка метода уничтожения раковых клеток путем доставки в них иода-125 и ингибитора антиапоптозных белков для направленного повреждения митохондриальных мембран и индукции апоптоза.

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-14-00094

НазваниеРазработка метода уничтожения раковых клеток путем доставки в них иода-125 и ингибитора антиапоптозных белков для направленного повреждения митохондриальных мембран и индукции апоптоза.

Руководитель Соболев Александр Сергеевич, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук , г Москва

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые слова Модульные нанотранспортеры, локально-действующие агенты, эмиттеры электронов Оже, опухолевые клетки, доставка к митохондриям, индукция апоптоза, радиоактивный изотоп 125I, рецепторы, рецептор-опосредуемый эндоцитоз, мембраны, pH-зависимые эффекты

Код ГРНТИ34.15.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Одной из основных задач при лечении онкологических заболеваний является создание эффективных противоопухолевых средств, минимально повреждающих нормальные клетки. Воздействие на уровне отдельной клетки способны обеспечить эмиттеры электронов Оже (ЭО) – частиц, в большинстве случаев имеющих малые длины пробега (порядка десятков нанометров) и достаточно высокую линейную передачу энергии, что обеспечивает локальное повреждающее воздействие. Одним из наиболее эффективных эмиттеров ЭО является 125I, который давно разрешен для медицинского применения. Для того чтобы направленно доставлять эмиттеры ЭО в чувствительные к повреждению части опухолевых клеток-мишеней, мы предлагаем разработанную заявителями мультифункциональную транспортную платформу модульных нанотранспортеров (МНТ). МНТ состоят из нескольких полипептидных модулей, каждый из которых выполняет отдельную функцию для осуществления перемещения МНТ к заданной уязвимой части опухолевой клетки. Выбор внутриклеточной мишени ЭО способен существенным образом повлиять на эффективность воздействия на клетку. Известно, что ядро клетки крайне чувствительно к ЭО, в то же время митохондрии, повреждение которых способно индуцировать апоптоз, также можно рассматривать как перспективную мишень для эмиттеров ЭО. Апоптоз – процесс контролируемой клеточной гибели, не вызывающий, в отличие от некроза, массированного выброса нежелательных биологически активных веществ. Для регулирования апоптоза в клетках существует баланс между проапоптотическими и антиапоптотическими белками, т.е. белками вызывающими и препятствующими апоптозу. В опухолевых клетках этот баланс часто нарушается в сторону антиапоптотических белков, благодаря чему эти клетки становятся способными к неконтролируемому делению. Более того, сверхэкспрессией антиапоптотических белков можно объяснить устойчивость многих раковых клеток к химиотерапевтическим агентам. Поэтому проверка возможности индуцирования апоптоза в опухолевой клетке-мишени является актуальной. Кроме того, как показал анализ известных данных, к настоящему времени практически отсутствуют сведения о влиянии эмиттеров ЭО на митохондрии. Это, наряду с созданием возможности селективно влиять на митохондрии клеток заданного типа, определяет научную новизну проекта. В настоящем проекте предполагается активировать апоптоз опухолевых клеток двумя путями. Во-первых, предполагается включить в состав МНТ, меченных 125I – эмиттером электронов Оже, модуль, направляющий эти МНТ к поверхности митохондрий. Это приведет к разрушению внешней мембраны митохондрий, выходу активаторов апоптоза и последующему апоптозу. Во-вторых, предполагается ингибировать антиапоптотические белки с помощью специального модуля, включенного в состав МНТ. Примером такого ингибитора может служить BIM-пептид, способный с высоким сродством взаимодействовать со всеми антиапоптотическими белками и вызывать, в конечном счете, апоптоз опухолевых клеток. Сочетание этих способов воздействия как в одном МНТ, так и в МНТ двух типов, по мнению заявителей, обеспечит эффективную гибель опухолевых клеток. Для достижения цели проекта необходимо также обеспечить устойчивое в клетке присоединение иода к МНТ. В ходе выполнения проекта будут созданы и охарактеризованы МНТ, несущие 125I и BIM-пептид (либо его аналоги), охарактеризованы вызванные доставкой в раковые клетки этих МНТ: повреждения внешней митохондриальной мембраны, апоптоз и гибель опухолевых клеток-мишеней.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Сластникова Т.А., Розенкранц А.А., Уласов А.В., Храмцов Ю.В., Лупанова Т.А., Георгиев Г.П., Соболев А.С. Mouse Syngeneic Melanoma Model with Human Epidermal Growth Factor Receptor Expression Pharmaceutics, V. 14, paper number 2448, pp. 1-14 (год публикации - 2022)
10.3390/pharmaceutics14112448

2. Петров С.А., Юсубов М.С., Белоглазкина Е.К., Ненайденко В.Г. Synthesis of Radioiodinated Compounds. Classical Approaches and Achievements of Recent Years International Journal of Molecular Sciences, Int. J. Mol. Sci., V. 23, Paper № 13789 (год публикации - 2022)
10.3390/ijms232213789

Публикации

1. Храмцов Ю.В., Уласов А.В., Сластникова Т.А., Розенкранц А.А., Лупанова Т.Н., Георгиев Г.П., Соболев А.С. Modular nanotransporters delivering biologically active molecules to the surface of mitochondria Pharmaceutics, V. 15. 2687. (год публикации - 2023)
10.3390/pharmaceutics15122687

2. Розенкранц А.А., Сластникова Т.А. Prospects of Using Protein Engineering for Selective Drug Delivery into a Specific Compartment of Target Cells Pharmaceutics, V. 15. 987 (год публикации - 2023)
10.3390/pharmaceutics15030987

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Проект направлен на разработку метода уничтожения раковых клеток путем доставки эмиттера электронов Оже иода-125 к митохондриям клеток-мишеней. Для этого на этапе 2024 года проведена трансформация клеток E. coli генетической конструкцией, кодирующей МНТБ2, и был выбран штамм E. coli, в котором наблюдается наибольшая экспрессия целевого МНТБ2 – Rosetta (DE3) pLysS. МНТБ2 содержит аффибоди к рецептору эпидермального фактора роста, транслокационный домен дифтерийного токсина в качестве эндосомолитического модуля, гемоглобиноподобный белок НМР E. coli в качестве модуля-носителя и проапоптотический Bim-пептид в качестве эффекторного модуля. МНТБ2 также содержит сайт отщепления Bim-пептида, узнаваемый эндосомальной протеазой катепсином В. Проведены выделение и очистка МНТБ2 из выбранного штамма E. coli. В результате получили МНТБ2 (чистота больше 70%) в количествах, достаточных для проведения всех последующих экспериментов. Методом проточной цитофлуорометрии с использованием флуоресцентно меченого МНТБ2 показано, что лигандный модуль в составе МНТБ2 сохраняет свою способность связываться с рецепторами эпидермального фактора роста (EGFR) и что связывание МНТБ2 с клетками A431 в основном обусловлено специфическим взаимодействием с рецепторами EGFR, а не другими возможными неспецифическими взаимодействиями. Показано, что эндосомолитический модуль в составе полученного МНТБ2 сохраняет свою функциональную активность и нарушает целостность липидных мембран при рН, характерных для эндосом. Отработан сайт-специфический способ присоединения изотопа иода к МНТ. Для этого выбран МНТ, содержащий на С-конце свободную SH группу цистеина, и получено способное взаимодействовать с ним малеимидное станнилированное производное (IBM), которое можно пометить стабильным или радиоактивным изотопом йода. Проведено мечение МНТЯ (вместо монободи к Keap1 у него находится сигнал ядерной локализации) изотопом иода-125 c помощью IBM по свободной SH группе цистеина. Радиохимическая чистота полученного меченного иодом-125 МНТЯ составила около 90%. Показано, что связь между IBM и МНТЯ не разрушается даже при температуре 99°С. Изучена собственная цитотоксичность полученных МНТБ1 и МНТБ2 без присоединенного цитотоксического агента. Показано, что статистически достоверная цитотоксичность проявляется только спустя третьи сутки после добавления МНТБ1 или МНТБ2. Установлено, при некоторых концентрациях МНТБ2 обладает большей собственной цитотоксичностью, чем МНТБ1. Получены и очищены МНТМ, МНТБ1 и МНТБ2, меченные иодом-125. Для этого использовали синтезированный на предыдущих этапах N-сукцинимидил-3-иодобензоат (SIB). С помощью метода комбинационного рассеяния было показано, что для (иод-125)-SIB-МНТБ1 и (иод-125)-SIB-МНТБ2 наблюдается частичный выход восстановленного цитохрома С из митохондрий клеток культуры А431. Это также может свидетельствовать о частичном повреждении внешней митохондриальной мембраны и начальных стадиях инициации цитохром С-зависимого апоптоза. В случае (иод-125)-SIB-МНТМ не наблюдалось выхода цитохрома С из митохондрий, однако при этом наблюдается увеличение относительного содержания восстановленного цитохрома С. Это указывает на замедление электронного транспорта и снижение синтеза АТФ в митохондриях, что может отражать общее повреждение клеток по цитохром С-независимому механизму. С помощью конфокальной микроскопии выявлены апоптотические изменения в клетках А431 после их инкубации с иодированными и неиодированными иодом-125 МНТ (МНТМ, МНТБ1, МНТБ2 и МНТЯ) в течение 2 суток. Далее препараты окрашивали специфическими красителями на апоптоз и некроз и с помощью конфокальной микроскопии определяли процент апоптотических клеток. Для групп, в которых клетки инкубировались с (иод-125) SIB-МНТБ1 или (иод-125) SIB-МНТБ2 наблюдалось достоверное увеличение числа апоптотических клеток по сравнению с контролем. Показано, что наибольшие апоптотические изменения происходят в группе, где клетки инкубировались с иод-125-SIB-МНТБ2. Проведено сравнение цитотоксичности разных МНТ (МНТМ, МНТБ1, МНТБ2 и МНТЯ), меченных иодом-125 (иод-125 SIB-МНТ), на клетках линий А431 и М3 с рецепторами к эпидермальному фактору роста (М3 EGFR, охарактеризованы на этапе Проекта прошлого года). Выживаемость клеток, определенная по тесту на образование колоний, оценивали на 2 сутки после добавления соответствующего радиоиодированного МНТ. Показано, что среди всех изученных МНТ наибольшей цитотоксичностью обладает (иод-125) SIB-МНТМ. Кроме выполнения пунктов настоящего этапа Проекта, была также более подробно изучено взаимодействие модуля-носителя НМР с Keap1. Показано, что за связывание с Keap1 отвечает альфа-спиральный N-концевой глобиновый домен НМР. Причем, установлено, что МНТ с таким усеченным НМР не теряют своих функциональных свойств. Данная работа была опубликована онлайн (https://www.mdpi.com/1999-4923/16/8/1083) в статье (Alieva et al., 2024), выпущенной в журнале Pharmaceutics (Q1). Таким образом, все поставленные задачи на этапе этого года были решены. Наиболее перспективным с точки зрения цитотоксичности является меченный иодом-125 МНТ, способный за счет монободи к Keap1 в своем составе связываться с поверхностью митохондрий. Апоптоз лучше всего вызывается меченным иодом-125 МНТ, содержащим Bim-пептид с возможностью его отщепления в эндосомах.

Публикации

1. Алиева Р.Т., Уласов А.В., Храмцов Ю.В., Сластникова Т.А., Лупанова Т.Н., Грибова М.А., Георгиев Г.П., Розенкранц А.А. Optimization of a modular nanotransporter design for targeted intracellular delivery of photosensitizer Pharmaceutics , 16, 1083 (год публикации - 2024)
10.3390/pharmaceutics16081083

2. Храмцов Ю.В., Уласов А.В., Сластникова Т.А., Георгиев Г.П., Соболев А.С. Увеличение накопления модульных нанотранспортеров в опухолях мышей путем присоединения к этим нанотранспортерам полиэтиленгликоля с возможностью его отщепления в опухоли Доклады Российской академии наук. Науки о жизни (год публикации - 2025)

Возможность практического использования результатов
Результаты настоящего проекта могут быть использованы в дальнейшем для создания новых противоопухолевых препаратов.