Протеом циркулирующих экзосом крови в динамике после ишемического инсульта: сопоставление с процессами восстановления и развитием отсроченных психоневрологических нарушений.

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 21-75-20112

НазваниеПротеом циркулирующих экзосом крови в динамике после ишемического инсульта: сопоставление с процессами восстановления и развитием отсроченных психоневрологических нарушений.

Руководитель Гехт Алла Борисовна, Доктор медицинских наук

Организация финансирования, регион Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы "Научно-практический психоневрологический центр имени З.П. Соловьева Департамента здравоохранения города Москвы" , г Москва

Конкурс №51 - Конкурс 2021 года по мероприятию «Проведение исследований на базе существующей научной инфраструктуры мирового уровня» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-106 - Нейробиология

Ключевые слова инсульт, экзосомы, микровезикулы крови, протеомика, повреждение мозга, нейровоспаление, постинсультная депрессия, когнитивные нарушения

Код ГРНТИ76.29.51

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
В результате острого нарушения мозгового кровообращения (ОНМК) развивается комплексная патофизиологическая реакция организма, имеющая как острые, так и отсроченные психоневрологические последствия, включающие когнитивное снижение и расстройства тревожно-депрессивного спектра. Эти нарушения, возникающие в отсроченном периоде вследствие повреждений мозга после ишемического инсульта, представляют значимую медицинскую и социальную проблему. Инсульт является второй по частоте причиной когнитивных расстройств после болезни Альцгеймера, а постинсультная депрессия, согласно данным мета-анализов, развивается, по меньшей мере, у 30% пациентов в течение 5 лет после события. Снижение когнитивной функции и депрессивные нарушения у пациентов после инсульта, как правило, связывают с уменьшением объема мезиальных структур (гиппокампа). На данный момент молекулярно-клеточные механизмы, которые предопределяют риск возникновения депрессии и деменции у перенесших инсульт пациентов остаются недостаточно изученными. Недавно членом нашего научного коллектива была сформулирована концепция о связи отсроченных психоневрологических последствий инсульта с дистантным повреждением гиппокампа (Гуляева Н.В., 2019). Согласно этой концепции в мозге после инсульта развивается процесс нейровоспаления, который приводит к постепенной деградации гиппокампа. Предполагается, что селективное действие нейровоспаления на гиппокамп обусловлено избыточным количеством кортикостероидных и цитокиновых рецепторов в этой структуре. В связи с этим изучение динамики изменения функционального статуса гиппокампа после ишемического инсульта представляется крайне важным для понимания механизмов предопределяющих отсроченные психоневрологические последствия инсульта, а также для поиска потенциальных маркеров отсроченных постинсультных нарушений. Очевидно, что исследование процессов, происходящих в мозге у людей возможно только косвенными методами. Большинство опубликованных научных исследований указывает на то, концентрация нейробиохимических параметров в системном кровотоке коррелирует с содержанием соответствующих показателей в мозге. Тем не менее, в сложнокомпонентной системе белков крови трудно объективно оценить уровень маркеров нейровоспаления из-за их низкого содержания и быстрой утилизации из кровотока. Кроме того, для многих биологически активных молекул мозга гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) слабопроницаем. Учитывая вышеизложенное, в представленном проекте будет предпринята попытка в качестве способа регистрации нарушений, происходящих в мозге после инсульта, использовать изменения белкового состава экзосом, циркулирующих в кровотоке. Хорошо известно, что экстраклеточные везикулы способны преодолевать ГЭБ. Экзосомы – микровезикулы размером 30-150 нм, секретируются многими клетками организма, в том числе нервными и глиальными. Мембрана экзосом содержит таргетные молекулы, то есть их популяционную принадлежность можно однозначно идентифицировать. Экзосомы устойчивы к действию ферментов крови и способны транспортировать многие биологически активные компоненты через ГЭБ. В настоящее время их диагностическое и прогностическое значение при болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, рассеянном склерозе и других неврологических заболеваниях не вызывает сомнения. Мы полагаем, что экзосомы, проникающие через ГЭБ в обоих направлениях и циркулирующие в биологических жидкостях организма, могут являться крайне перспективным способом оценки изменений, происходящих в мозге. Основываясь на предположении, что протеом экзосом отражает патологические изменения структур мозга, в представленном проекте запланировано выделение циркулирующих экзосом крови у пациентов после ишемического инсульта в динамике с последующей идентификацией экзосомальных белков с помощью протеомных технологий. Мы полагаем, что полученная информация об изменениях протеома экзосом, проанализированная в комплексе с другими характеристиками, позволит более полно охарактеризовать функциональное состояние гиппокампа на разных сроках после ишемического инсульта. Полученные данные также планируется сопоставить с изменениями в гипоталамо-гипофизарной надпочечниковой системе (ГГНС), в системе цитокинов и клиническими показателями пациентов для оценки роли экзосом в качестве потенциальных предикторов отдаленных последствий инсульта, таких как депрессия и деменция. Таким образом, в настоящем проекте мы планируем выделять экзосомальную фракцию сыворотки крови пациентов в остром периоде, а также через 6 месяцев, 1 год и 2 года после ишемического инсульта с использованием коммерческих систем для выделения экзосом с последующим анализом протеома экзосом методом масс-спектрометрии. Необходимо отметить, что в настоящее время данные об изменениях белкового состава экзосом крови в динамике после ишемического инсульта практически отсутствуют, подобное исследование будет проведено впервые. Содержание кортизола и ИЛ-6 в сыворотке крови, а также содержание адренокортикотропного гормона (АКТГ) в плазме крови для оценки состояния ГГНС и системы цитокинов будет определено методом иммуноферментного анализа на каждой из этих временных точек. На этих же временных точках у каждого пациента будут оценены функциональное восстановление (обследование врачом-неврологом и стандартизованные шкалы), когнитивная функция (нейропсихологическое тестирование и стандартизованные шкалы), психоэмоциональный статус (обследование врачом-психиатром и стандартизованные шкалы), уровень стресса (стандартизованные шкалы). Предлагаемый проект предлагает решить конкретную задачу идентификации факторов, приводящих к постинсультным осложнениям в рамках перехода к персонифицированной медицине, высокотехнологичному здравоохранению и технологиям здоровьесбережения Стратегии НТР РФ.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. А.А. Яковлев НЕЙРОПРОТЕКТОРНОЕ ВЛИЯНИЕ АСТРОЦИТАРНЫХ ЭКСТРАКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ ПРИ ИНСУЛЬТЕ Журнал «НЕЙРОХИМИЯ», 2 (год публикации - 2022)

Публикации

1. Яковлев А.А., Дружкова Т.А., Соловьева Н.А., Гехт А.Б., Гуляева Н.В. СРАВНЕНИЕ МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ ЭКСТРАКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ ИЗ СЫВОРОТКИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА Журнал "НЕЙРОХИМИЯ" (год публикации - 2023)

2. Яковлев А.А. Экзосомы мозга как новая система сигналинга Журнал "БИОХИМИЯ" (год публикации - 2023)

3. Жанина М.Ю., Дружкова Т.А., Яковлев А.А., Владимирова Е.Е., Фрейман С.В., Еремина Н.Н., Гехт А.Б., Гуляева Н.В. Development of Post-Stroke Cognitive and Depressive Disturbances: Associations with Neurohumoral Indices Current Issues in Molecular Biology, 44, 12, 6290-6305 (год публикации - 2022)
10.3390/cimb44120429

Публикации

1. Жанина М.Ю., Дружкова Т.А., Яковлев А.А., Гехт А.Б., Гуляева Н.В. Количественный и качественный анализ экзосом сыворотки крови на разных сроках после ишемического инсульта НЕЙРОХИМИЯ (год публикации - 2024)

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Было продолжено обследование пациентов на разных сроках после ишемического инсульта (ИИ), проходивших лечение в 2022–2024 гг. в ГБУЗ им. Кончаловского ДЗМ. Все испытуемые соответствовали критериям включения в исследование. Были обследованы 34 пациентов в остром периоде после ИИ, 13 пациента , через месяц, через 6 месяцев и после 12 месяцев после ИИ, 7 пациентов через 12 месяцев и 24 месяца после ИИ. Были проведены клинические (оценка неврологических, психиатрических и когнитивных показателей), инструментальные (МРТ и морфометрический анализ структур головного мозга) и лабораторные обследования пациентов на указанных сроках после ИИ. Был проведен сравнительный протеомный анализ 32 образцов экзосомальной фракции сыворотки крови от пациентов после ИИ с разным когнитивным статусом. Перед проведением протеомного анализа в пробах экзосомальной фракции крови проводили солюбилизацию белков, гидролиз белков трипсином, и определяли концентрацию пептидов в полученном растворе. Была проведена оценка полноты гидролиза белков. Масс-спектрометрический анализ проводили на масс-спектрометре Q-Exactive HFX в режиме положительной ионизации с использование источника NESI («ThermoScientific», США). Для идентификации белков использовали программное обеспечение MaxQuantv.2.0.3.0 с поисковым алгоритмом Andromeda, а также базу данных протеома человека в UniProt (UP000005640). Мечение пептидов проводили с использованием 10-плексного набора меток ТМТ. Полученные пептиды анализировали на ВЭЖХ-МС/МС. Был проведен сравнительный анализ белковых профилей экзосом на разных сроках после ИИ. При сравнительной оценке белковых профилей экзосом сыворотки крови не было выявлено четкого разделения образцов по белковым профилям на разных сроках после ИИ. Тем не менее, были выявлены некоторые аполипопротеины (Апо-А1; Аpo-L1иАпо-В) и иммуноглобулины (immunoglobulin Kappa Variable 1-8 immunoglobulin J chain) по уровню которых были найдены различия в экзосомальный фракции крови пациентов на разных сроках после ИИ. Сравнение белковых профилей экзосом сыворотки крови пациентов не выявило значимых различий в уровнях белков в первый день и через месяц после ИИ. При сравнении белковых профилей экзосом пациентов, обследованных через месяц и через год после ИИ, были найдены достоверные различия по экспрессии 13 белков. Среди них 50% составляли белки, участвующие в процессе свертывания крови, около 30% - иммуноглобулины и приблизительно 20 % - аполипопротеины. При сравнении белковых профилей экзосом сыворотки крови пациентов через месяц и 1,5-2 года после ИИ были найдены достоверные различия по экспрессии 31 белка. Практически все белки с достоверно повышенным уровнем через 1,5-2 года после ИИ по сравнению с более ранним сроком были связаны с активацией/регуляцией иммунной системы. Уровень остальных экзосомальных белков (20% белков, регулирующих липидный обмен, 50% белков, связанных со свертываемостью крови и гомеостазом) был достоверно понижен у пациентов через 1.5-2 года после ИИ по сравнению с показателями пациентов, обследованных через месяц после ИИ. Наиболее выраженные различия в экзосомальной фракции пациентов, обследованных через месяц и через 1,5-2 года после ИИ, были выявлены по уровню C1q, C1s, C1r. Последующий анализ показал, что при иерархической кластеризации произошло разделение образцов по белковым профилям групп пациентов, обследованных до года и более года после ИИ, что подтвердило ранее полученные результаты. Дальнейшее анализ был направлен на выявление различий в белковых профилях сывороточных экзосом пациентов на поздних сроках после ИИ с отсроченными когнитивными и эмоциональными нарушениями и без таких нарушений. На сроке более года после ИИ были сформированы две группы пациентов на основе порогового балла MoCA 26: пациенты с когнитивными симптомами (оценка по шкале MoCA <25, n=11) и пациенты без когнитивных симптомов (оценка по шкале MoCA≥26, n=19). Все пациенты с когнитивными симптомами имели умеренные когнитивные нарушения (УКН) (шкала MoCA >17). Показатели NIHSS, указывающие на неврологический дефицит, статистически не различались между пациентами с УКН и пациентами без УКН на всех сроках обследования. У пациентов с выявленным УКН в отдаленном постинсультном периоде наблюдался более высокий уровень экзосом в сыворотке крови (р<0,04) по сравнению с пациентами без когнитивных симптомов. При иерархической кластеризации произошло разделение белковых профилей пациентов с УКН и без УКН. Было установлено, что практически все белки с повышенным уровнем, выделенные из экзосомальной фракции пациентов с УКН, по сравнению с показателями пациентов без УКН, были задействованы в активации и/или регуляции иммунного ответа Примерно 40% из них составляли белки системы комплемента, а также белки, связанные со свертываемостью крови. Наиболее выраженные различия были выявлены по уровню С3, С5, С7, С1q и CD5. У пациентов с УКН были найдены положительные корреляции между уровнем С8 и количеством экзосом в сыворотке крови (R=0,72; p=0,02), между уровнем CD5 и уровнем С3 (R=0,7; p=0,03). Было показано, что более 70% белков, имеющих пониженные уровни в экзосомальной фракции пациентов с УКН, по сравнению с пациентами без УКН, связаны с липидным обменом. Различия между группами были выявлены по уровням сывороточного амилоида А2, А4, а также по ряду аполипопротеинов высокой плотности (Апо-А-1, Апо-А-1V, Апо-С-I, Апо-С-III, Апо-L-1) и по уровням белков, регулирующих и/или входящих в состав хиломикронов, а также липопротеинов низкой и очень низкой плотности (Апо-С-IV, Апо-В, Апо-Н, Апо-Е). Для поиска ассоциаций белковых профилей экзосом пациентов с развитием отсроченных постинсультных когнитивных и эмоциональных нарушений были оценены корреляции белков экзосом с данными психометрических шкал. Результаты показали, что у пациентов с УКН были обнаружены: сильные положительные корреляции показателей шкалы HADS с уровнем С3-компонента комплемента (R=0,9; p=0,003), показателей шкал HADS и MoCA с уровнями экзосомальных иммуноглобулинов, показателей по шкале MoCA с уровнем Apo-A-I (R=0,8; p=0,006). У пациентов без отсроченных постинсультных нарушений такие корреляции выявлены не были. Был проведен сравнительный анализ L1CAM-положительных экзосом сыворотки крови, пациентов после ИИ, имеющих различный когнитивный статус. В результате протеомного анализа было суммарно определено 180 белков, их которых 131 белковая группа отвечали критерию достоверной идентификации. Было выявлено 10 статистически значимых дифференциально экспрессированных белков, из них 5 белков были понижены в группе пациентов с умеренными когнитивными нарушениями через 14 дней после ишемического инсульта и 5 белков - повышены. При этом 4 белка превышали кратность различий более чем в 2 раза (Actin, cytoplasmic 1, Ig alpha-1 chain C region, Junction plakoglobin и Prothrombin).

Публикации

1. Жанина М.Ю., Дружкова Т.А., Иерусалимский Н.В., Владимирова Е.Е., Еремина Н.Н., Гехт А.Б., Гуляева Н.В. Decreased volumes of selected cortical and limbic structures of the brain are associated with post-stroke cognitive and affective disorders: multiple hit scenarios? Neurochemical Journal, Neurochemical Journal, 2024, Vol. 18, No. 2, pp. 348–361. © Pleiades Publishing, Ltd., 2024. (год публикации - 2024)
DOI: 10.1134/S1819712424020193

2. Дружкова Т.А, Жанина М.Ю, Владимирова Е.Е., Гехт А.Б., Гуляева Н.В. Proteomic Spectrum of Serum Exosomes in Ischemic Stroke Patients Is Associated with Cognitive Impairmant in the Post-Stroke Period Biochemistry (Mosc), Biochemistry (Moscow).-2024.-V.89.-№9.-P.1595-1609 (год публикации - 2024)
doi: 10.1134/S0006297924090062

3. Жанина М.Ю., Дружкова Т.А., Владимирова Е.Е., Гехт А.Б., Гуляева Н.В. КОГНИТИВНЫЙ СТАТУС ПАЦИЕНТОВ ПОСЛЕ ИШЕМИЧЕСКОГО ИНСУЛЬТА АССОЦИИРОВАН С УРОВНЯМИ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО АКТИНА 1 И НЕКОТОРЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ В L1CAM-ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛАХ СЫВОРОТКИ КРОВИ НЕЙРОХИМИЯ (год публикации - 2024)

Возможность практического использования результатов
Полученные при выполнении проекта научные результаты вносят существенный вклад в формирование научного задела, касающегося прогнозирования развития постинсультных нарушений когнитивной и эмоциональной сфер. В соответствии с документом "Основные направления деятельности Правительства Российской Федерации на период до 2024 года" (утв. Правительством РФ 29.09.2018)", одним из основных приоритетов является обеспечение повышение ожидаемой продолжительности жизни. Для достижения позитивных демографических трендов Правительство Российской Федерации планирует реализацию комплекса мер по снижению смертности населения и росту продолжительности здоровой жизни. Указом Президента РФ от 18 июня 2024 года № 529 утверждены приоритетные направления научно-технологического развития и перечень важнейших наукоемких технологий, в частности: 2. Превентивная и персонализированная медицина, обеспечение здорового долголетия. Улучшение прогнозирования исходов инсульта у человека способствует повышению продолжительности жизни пациентов за счет возможности более раннего выявления и предупреждения поздних постинсультных расстройств.