Комплексная характеристика и изучение механизма действия практически значимых белковых молекул на основе флуоресцентных белков

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 21-74-20135

НазваниеКомплексная характеристика и изучение механизма действия практически значимых белковых молекул на основе флуоресцентных белков

Руководитель Бойко Константин Михайлович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" , г Москва

Конкурс №51 - Конкурс 2021 года по мероприятию «Проведение исследований на базе существующей научной инфраструктуры мирового уровня» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые слова Кальциевые индикаторы, клеточные сенсоры, флуоресцентные таймеры, цветной белок, пространственная структура, кристаллизация, рентгеноструктурный анализ

Код ГРНТИ34.15.15

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Одним из важнейших достижений современной молекулярной биологии является возможность визуализации процессов, происходящих внутри клетки, как на уровне их пространственной локализации, так и во временной развертке. Эксперименты такого рода стали возможны благодаря открытию так называемых флуоресцентных белков (ФБ), являющихся генетически кодируемыми (т.е. без необходимости доставки в клетку извне) маркерами, идеальными для анализа локализации клеток, клеточных органелл и белков по флуоресцентному сигналу. Широкий спектр ФБ с различными свойствами представляет собой удобный набор инструментов для молекулярных клеточных биологов, позволяющий отслеживать целевые молекулы или клетки в модельном организме, которые могут быть помечены генетически. Более того, возможность одновременного использования нескольких ФБ с разными спектральными характеристиками привела к развитию новых методов оптической микроскопии, позволяющих изучать многофакторные процессы в живой клетке и многоклеточных организмах. Несмотря на широкое использование ФБ, спектр их применения ограничен рамками их характеристик (спектральных, яркостных и др.), что ограничивает диапазон их применения. В связи с этим существует большая потребность в получении ФБ (или белков на их основе) с определенными характеристиками. В свою очередь характеристики ФБ напрямую связаны с их пространственным строением и, в частности, с пространственным окружением хромофора. Выяснение структурных данных о таких белках позволит использовать методы генетической инженерии для направленного воздействия на их характеристики для тонкой настройки под требуемые задачи визуализации. В рамках проекта планируется провести комплексную структурно-функциональную характеристику двух типов биологических молекул, основанных на ФБ и имеющих важное прикладное значение (см. разделы 4.3 и 4.5 Заявки). Первым типом являются т.н. клеточные таймеры – генетически кодируемые белки, способные менять длину волны своей флуоресценции в процессе созревания, длящегося достаточно продолжительное время (от минут до десятков часов). К белкам данного типа в настоящее время прикован значительный интерес благодаря их применимости для in vivo визуализации и количественного определения продолжительности фаз клеточного цикла. Вторым типом изучаемых молекул являются химерные сенсоры на различные клеточные мессенджеры (кальций, калий и пр.). Такие молекулы позволяют проводить прижизненный анализ концентрации мессенджеров в клетках и, соответственно, in vivo контролировать их активность. Таким образом, исследование указанных белковых молекул является актуальной и значимой научной задачей. Основными задачами, решаемыми в раках проекта, являются: 1. Создать генетические конструкции для экспрессии изучаемых белков. 3. Провести гетерологическую экспрессию целевых белков, их выделение и очистку для последующих исследований. 4. Провести детальную физико-химическую характеристику полученных белков, в частности, определить их спектральные свойства, молекулярную яркость, полувремена созревания, фотостабильность. 5. Провести с использованием синхротронного излучения рентгеноструктурный анализ полученных белков, выявить и верифицировать структурные мотивы, ответственные за определенные (см. п.4) характеристики белков, описать процессы, происходящие при их функционировании. Научная новизна исследования определяется в первую очередь новизной самих объектов исследования – новых таймеров клеточного цикла и химерных сенсоров (индикаторов) с уникальными характеристиками, которые будут исследованы впервые. Повышенный интерес к разработке подобного рода белков обусловливает соответствие полученных результатов мировому уровню исследований в данной области.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Субач О.М., Власкина А.В., Агапова Ю.К., Дороватовский П.В., Николаева А.Ю., Ивашкина О.И., Попов В.О., Пяткевич К.Д., Хренова М.Г., Бойко К.М., Субач Ф.В. LSSmScarlet, dCyRFP2s, dCyOFP2s and CRISPRed2s, Genetically Encoded Red Fluorescent Proteins with a Large Stokes Shift International Journal of Molecular Sciences, 22, 12887 (год публикации - 2021)
10.3390/ijms222312887

2. Субач О.М., Ташкевич А., Власкина А.В., Петренко Д.Е, Гайворонский Ф.А., Николаева А.Ю., Ивашкина О.И., Хренова М.Г., Анохин К.В., Попов В.О., Бойко К.М., Субач Ф.В. The mRubyFT protein, Genetically Encoded Blue-to-Red Fluorescent Timer International Journal of Molecular Sciences, 23, 3208 (год публикации - 2022)
10.3390/ijms23063208

3. Субач О.М., Власкина А.В., Агапова Ю.К., Корженевский Д.А., Николаева А.Ю., Варижук А.М., Субач М.Ф., Патрушев М.В., Пяткевич К.Д., Бойко К.М., Субач Ф.В. cNTnC and fYTnC2, Genetically Encoded Green Calcium Indicators based on Troponin C from Fast Animals International Journal of Molecular Sciences, 23, 14614 (год публикации - 2022)
10.3390/ijms232314614

4. Бойко К.М., Николаева А.Ю., Дороватовский П.В., Власкина А.В., Субач О.М., Субач Ф.В. Three-Dimensional Structure of the S148F Mutant of Blue-to-Red Fluorescent Timer mRubyFT Crystallography Reports (год публикации - 2022)

5. Субач О.М., Варфоломеева Л.А., Власкина А.В., Агапова Ю.К., Николаева А.Ю., Пяткевич К.Д., Патрушев М.В., Бойко К.М., Субач Ф.В. FNCaMP, Ratiometric Green Calcium Indicator based on mNeonGreen protein Biochemical and Biophysical Research Communications, 65, 169-177 (год публикации - 2023)
10.1016/j.bbrc.2023.04.108

6. Бойко К.М., Хренова М.Г., Николаева А.Ю., Дороватовский П.Г., Власкина А., Субач О.М., Попов В.О., Субач Ф.В. Combined structural and computational study of the mRubyFT fluorescent timer locked in its blue form International Journal of Molecular Sciences, 24, 7906 (год публикации - 2023)
10.3390/ijms2409790

7. Субач О.М., Власкина А.В., Агапова Ю.К., Николаева А.Ю., Анохин К.В., Пяткевич К.Д., Патрушев М.В., Бойко К.М., Субач Ф.В. The Blue-to-Red TagFT, mTagFT, mTsFT, and Green-to-FarRed mNeptusFT2 Proteins, Genetically Encoded True and Tandem Fluorescent Timers International Journal Of Molecular Sciences, 24, 3279 (год публикации - 2023)
10.3390/ijms24043279

8. Николаева А.Ю., Субач О.М., Варфоломеева Л.А., Власкина А.В., Агапова Ю.К., Пяткевич К.Д., Бойко К.М., Субач Ф.В ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА НОВОГО РАЦИОМЕТРИЧЕСКОГО КАЛЬЦИЕВОГО ИНДИКАТОРА FNCAMP НА ОСНОВЕ ЯРКОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО БЕЛКА MNEONGREEN И КАЛЬМОДУЛИНА- М13 ПЕПТИДА ИЗ ASPERGILLUS NIGER ООО «АДМИРАЛ ПРИНТ», Москва, 1 (год публикации - 2023)
10.25998/msl.2023.78.95.001

9. Александра В. Гавшина, Илья Д. Соловьев, Мария Г. Хренова, Константин М. Бойко, Лариса А. Варфоломеева, Михаил Е. Миняев, Владимир О. Попов, Александр П. Савицкий The role of the correlated motion(s) of the chromophore in photoswitching of green and red forms of the photoconvertible fluorescent protein mSAASoti Scientific Reports, 14, 8754. (год публикации - 2024)
10.1038/s41598-024-59364-1

10. Цуйсинь Лай, Лина Ян, Вишака Патиранадж, Жуйчжао Ван, Федор В. Субач, Элис Р. Уокер, Кирил Д. Пяткевич Genetically encoded green fluorescent sensor for probing sulfate transport activity of solute carrier family 26 member a2 (Slc26a2) protein Communications Biology, 7:1375 (год публикации - 2024)
10.1038/s42003-024-07020-9

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
На отчетном этапе проекта были проведены следующие работы: • С использованием методов молекулярного моделирования были разработаны генетические конструкции для экспрессии зеленого кальциевого сенсора FAaCaMP (в качестве кальций-связывающего домена был выбран CaM-M13-комплекс из грибов S. pombe, который так же имеет высокую гомологию с CaM-M13-комплексом из H. sapiens и M. musculus), сенсора для визуализации фосфорилирования белка CREB (NeCREB), зеленого белка mBaoJin2 с улучшенными хараткоеристиками и фотоактивируемого белка PA-mBaoJin на основе зеленого белка mBaoJin2. Проведена экспрессия целевых белков в бактериальной системе экспрессии. • Проведено выделенные и хроматографическая очистка до гомогенного состояния целевых белков для последующих физико-химических и структурных исследований. На этой стадии к объектам исследования был добавлен зеленый флуоресцентный сенсор, перспективный для оценки транспорта сульфата - Slc26a2. • Проведена функциональная и физико-химическая характеристика очищенных целевых белков (FAaCaMP, NeCREB, mBaoJin2 и фотоактивируемого PA-mBaoJin). В частности был исследован олигомерный состав, спектры поглощения и флуоресценции, яркость, контраст, сродство к ионам кальция (для кальциевых сенсоров), фотостабильность и др. • Проведен широкий скрининг условий кристаллизации по результатам которого подобраны и оптимизированы условия кристаллизации ряда очищенных целевых белков (FAaCaMP и mBaoJin2). Получены кристаллы указаных белков, пригодные для рентгеноструктурного анализа, а также кристаллы мутантной по остаткам цистеина формы фотопереключаемого флуоресцентного белка SAASoti (moxSAASoti). Для белков NeCREB, PA-mBaoJin и Slc26a2 получить условия в которых бы наблюдался рост кристаллов, пригодных для рентгеноструктурного анализа, не удалось. • Проведено тестирование полученных кристаллов белков FAaCaMP, mBaoJin2 и moxSAASoti на синхротронном источнике НИЦ «Курчатовский институт» в части оценки дифракционного предела, точечной и пространственной групп симметрии и мозаичности. Собраны дифракционные наборы, проведена их первичная обработка, методом молекулярного замещения решены и кристаллографически уточенны пространственные структуры целевых белков - FAaCaMP, mBaoJin2 и moxSAASoti. Проведен сравнительный анализ полученных пространственных структур и выявленные структурные мотивы, влияющие на исследуемые характеристики целевых белков. По результатам работ опубликованы две статьи в журналах из первого квартиля. Еще две статьи находятся на финальной стадии подготовки. Результаты проекта были использованы при разработке курса "Рентгеноструктурный анализ", читаемого руководителем проекта в рамках магистерской программы биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова "Структурная биология и биотехнология". Результаты проекта также были использованы руководителем проекта при подготовке лекции и практикума на III Школе молодых ученых "Применение синхротронного излучения для решении задач биологии" (Новосибирск, 18-20.09.2024).

Публикации

Возможность практического использования результатов
Спектр медицинских приложений флуоресцентных белков весьма обширен и включает, в частности, прижизненный биоимиджинг для изучения биораспределения, тропизма, пролиферации и дифференцировки стволовых клеток и их взаимодействия с опухолями; использование флуоресцентных белков, способных производить активные формы кислорода (фотосенсибилизаторов) при облучении светом, для избирательного светоиндуцируемого уничтожения клеток; отслеживание колебаний концентрации определенных соединений на уровне единственной клетки или в клеточном компартменте и др. В этой связи результаты проекта могут иметь практическое приложение в части разработки флуоресцентных меток, являющихся отечественными аналогами используемой в настоящее время иностранной продукции. В частности, такие разработки будут востребованы отечественными компаниями, работающими в предметной области (Евроген, Lumiprobe и др.).