Метаболическая инженерия микробных продуцентов для промышленной биотехнологии: получение ценных изопреноидных синтонов из природных стеринов

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 21-64-00024

НазваниеМетаболическая инженерия микробных продуцентов для промышленной биотехнологии: получение ценных изопреноидных синтонов из природных стеринов

Руководитель Донова Марина Викторовна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук» , Московская обл

Конкурс №56 - Конкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по поручениям (указаниям) Президента Российской Федерации» (генетические исследования)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-209 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Ключевые слова Метаболическая инженерия, гетерологическая экспрессия, рекомбинант, актинобактерии, мицелиальные грибы, стероид, изопреноид, фитостерин, биоконверсия

Код ГРНТИ62.09.39

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Проект направлен на создание научно-технологического задела для промышленной микробиологии, связанной с биоконверсией природных стеринов. Основными задачами Проекта являются создание перспективных для промышленного использования новых генно-модифицированных и трансгенных микроорганизмов, продуцирующих из дешевых и доступных фитостеринов продукты с высокой добавленной стоимостью – изопреноидные синтоны стероидного и инданового ряда. Разработка на их основе биотехнологий нового поколения открывает перспективы создания производства целой линейки важных соединений для фармацевтики, биомедицины, ветеринарии и других отраслей. Особенно актуальным такое производство является для России: обладая неисчерпаемыми природными ресурсами для производства высококачественных фитостеринов (лесохимическая отрасль), наша страна является единственным крупным государством, не имеющим собственного производства полного цикла стероидных препаратов. Несмотря на значительный прогресс в области изучения катаболизма природных стеринов у актинобактерий, остаются значительные пробелы в понимании генетического контроля ключевых этапов окислительной деградации боковой цепи и колец C/D-стероидного ядра у непатогенных видов. Восполнение этих пробелов является необходимым для создания высокопроизводительных рекомбинантных штаммов, способных селективно продуцировать ценные изопреноидные метаболиты. Актуальной проблемой является также расширение арсенала методов для направленной структурной модификации микроорганизмами стероидов и других терпеноидных липидов, таких как оксифункционализация неактивных углеродных атомов, в том числе регио- и стереоспецифическое гидроксилирование гонанового ядра и боковой цепи стеринов. Решение проблемы связано с генетической инженерией микроорганизмов, в том числе, путем экспрессии чужеродных систем стероидогенеза в микробных хозяевах. В задачи Проекта входит получение новых рекомбинантных микробных штаммов, способных конвертировать фитостерины в С22-, С24- и С26-стероиды, в том числе, 9-гидроксированные, и ненасыщенные при С-17(20), а также новых улучшенных промышленных штаммов - продуцентов С19-стероидов и инданонов. Для решения этих задач в микобактериальных клетках будут модифицированы пути окислительной деградации боковой цепи фитостеринов с переключением метаболических потоков в сторону накопления целевых стероидов, а также блокированы нежелательные активности, приводящие к образованию побочных продуктов. Другим направлением исследований является создание (с применением синтетических оперонов) и изучение функциональных свойств рекомбинантных микроорганизмов, экспрессирующих чужеродные системы стероидогенеза. На основе уникального высокопроизводительного цитохрома P450 BM3 из Bacillus megaterium планируется создание микобактериального трансгенного штамма, осуществляющего окислительную деградацию фитостерина с одновременным регио- и стереоселективным 7бета-гидроксилированием стероидов. Кроме того, будут изучены новые стероидные гидроксилазы мицелиальных грибов, обладающие высокой активностью в отношении стероидов андростанового ряда, идентифицированы кодирующие их гены и на основе их гетерологической экспрессии созданы эффективные рекомбинантные микробные продуценты диастереомеров стероидных спиртов (7бета, 11альфа и других). С учетом высокой актуальности проблемы получения эффективных противовирусных препаратов (в том числе против коронавирусов), на основе экспрессии генов микобактериальных монооксигеназ, гидроксилирующих холестерин при С26, будут созданы рекомбинантные микробные продуценты 26-гидроксистероидов, изучены их функциональные характеристики, получены новые производные для биомедицинских исследований. Перспективные для биотехнологического применения рекомбинантные штаммы будут использованы при создании новых биопроцессов – прототипов промышленных биотехнологий. Этапами их разработки будут оптимизация условий роста созданных микробных штаммов и биоконверсии ими фитостеринов, масштабирование от колбочного уровня до уровня лабораторных (или пилотных) биореакторов, отработка режимов ферментации, разработка процедур выделения и очистки целевых продуктов с получением кристаллических субстанций высокого качества. В ходе выполнения проекта будут получены приоритетные научные результаты о генетическом контроле окислительной деградации боковой цепи стеринов и глубокого окисления стероидного ядра (колец C и D), управляемой гетерологической экспрессии чужеродных генов в бактериальных и дрожжевых хозяевах, функциональных особенностях бактериальных и эукариотических цитохром P450-монооксигеназ, осуществляющих регио- и стереоспецифические реакции гидроксилирования стероидов. Комплексное решение фундаментальных задач в области генетической и метаболической инженерии стероидтрансформирующих штаммов и микробиологической трансформации природных стеринов позволит создать научную основу для создания нового поколения микробных продуцентов и инновационных биопроцессов для промышленной микробиологии. Практическая значимость проекта состоит в создании новых эффективных микробных продуцентов и разработке на их основе прототипов промышленных биотехнологий нового поколения, открывающих перспективы создания многоцелевых микробиологических производств, в которых на одной технологической линии возможна продукция из фитостерина целого ряда востребованных продуктов. Залогами успешного выполнения проекта является профессиональная команда исполнителей - специалистов в области молекулярной биологии, генетической инженерии, микробиологии, биотехнологии, химии, а также весомый научный задел по тематике проекта и практический опыт разработки и масштабирования биотехнологий, а также, несомненно, поддержка проекта компаниями, заинтересованными в дальнейшем практическом применении его результатов.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Карпов М.В., Николаева В.М., Фокина В.В., Шутов А.А., Казанцев А.В., Стрижов Н.И., Донова М.В. Конструирование и функциональный анализ рекомбинантных штаммов Mycolicibacterium smegmatis, несущих гены бациллярных цитохромов CYP106A1 и CYP106A2 Биотехнология, Т. 37, № 6, С. 26-39 (год публикации - 2021)
10.21519/0234-2758-2021-37-6-26-39

2. Коллеров В.В., Шутов А.А., Казанцев А.А., Донова М.В. Steroid modification by filamentous fungus of Drechslera sp.: focus on 7-hydroxylase and 17β-hydroxysteroid dehydrogenase activities Fungal Biology, 2021 (год публикации - 2021)
10.1016/j.fungbio.2021.11.002

3. С. Хомутов, А. Шутов, А. Аверин, Д. Довбня, М. Донова Laccase - mediated oxidation of steroid alcohols in the presence of methylated β-cyclodextrin: from inhibition to selective synthesis Journal of Chemical Technology and Biotechnology (год публикации - 2021)
10.1002/jctb.7000

4. В. Коллеров, А. Шутов, А. Казанцев, М. Донова Hydroxylation of pregnenolone and dehydroepiandrosterone by zygomycete Backusella lamprospora VKM F-944. Selective production of 7α-ОН-DHEA Applied Microbiology and Biotechnology (год публикации - 2022)

5. Т. Лобастова, В. Фокина, С. Тарлачков, А. Шутов, Е. Брагин, А. Казанцев, М. Донова Steroid Metabolism In Thermophilic Actinobacteria Saccharopolyspora hirsuta VKM Ac-666 Microorganisms, 9, 2554-72 (год публикации - 2021)
10.3390/microorganisms9122554

6. Фокина В.В., Шутов А.А., Брагин Е.Ю., Донова М.В. Секретируемая холестериноксидаза Nocardioides simplex BKM Ac-2033D. 3-й Российский микробиологический конгресс, материалы конгресса / Псков: ООО «Конкорд», 2021, с. 274 (год публикации - 2021)

7. Донова М.В., Стрижов Н.И., Ивашина Т.В.. Довбня Д.В., Карпов М.В., Брагин Е.Ю Актинобактерии рода Mycolicibacterium как платформа для создания микробных продуцентов ценных стероидных соединений 3-й Российский микробиологический конгресс, материалы конгресса / Псков: ООО «Конкорд», 2021, с. 37 (год публикации - 2021)

8. Коллеров В.В., Тарлачков С.В., Шутов А.А., Донова М.В Разработка подходов к повышению селективности гидроксилирования стероидов микромицетом Drechslera sp. Ph F-34. 3-й Российский микробиологический конгресс, материалы конгресса / Псков: ООО «Конкорд», 2021, с. 200 (год публикации - 2021)

9. Фуфаева С. Р., Ивашина Т. В., Довбня Д. В., Шутов А. А., Донова М. В. Гетерологическая экспрессия гена kstD2 из Nocardioides simplex ВКМ Ac-2033Д в клетках миколицибактерий 3-й Российский микробиологический конгресс, материалы конгресса / Псков: ООО «Конкорд», 2021, с. 276-277 (год публикации - 2021)

10. Карпов М.В., Николаева В.М., Фокина В.В., Шутов А.А., Казанцев А.В., Стрижов Н.И., Донова М.В. Конструирование и функциональный анализ рекомбинантных штаммов Mycolicibacterium smegmatis, несущих гетерологичные гены стероидных монооксигеназ 3-й Российский микробиологический конгресс, материалы конгресса / Псков: ООО «Конкорд», 2021, с. 92 (год публикации - 2021)

11. Коллеров В.В., Шутов А.А., Тарлачков С.В., Донова М.В. 17β-Гидроксистероид дегидрогеназная и 7-гидроксилазная активность грибного штамма Drechslera sp.: специфичность, индуцибельность, транскриптомный анализ VII Пущинская школа-конференция "Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов" (6-9 декабря 2021 г.) Пущино, Сборник тезисов С. 247-249 (год публикации - 2021)
10.34756/GEOS.2021.17.38024

12. Фокина В.В., Брагин Е.Ю., Шутов А.А., Донова М.В. Холестериноксидаза актинобактерий Nocardioides simplex. VII Пущинская школа-конференция "Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов" (6-9 декабря 2021 г.) Пущино, Сборник тезисов С. 284-286 (год публикации - 2021)
10.34756/GEOS.2021.17.38047

13. Брагин Е.Ю., Довбня Д.В., Донова М.В. Выявление генов, характерных для бактерий, обладающих стероидным катаболизмом. VII Пущинская школа-конференция "Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов" (6-9 декабря 2021 г.) Пущино, Сборник тезисов С. 129-130 (год публикации - 2021)
10.34756/GEOS.2021.17.37946

14. Фуфаева С.Р., Довбня Д.В., Ивашина Т.В., Шутов А.А., Донова М.В. Анализ функции гена kstD2 из Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д. VII Пущинская школа-конференция "Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов" (6-9 декабря 2021 г.) Пущино, Сборник тезисов С. 286-288 (год публикации - 2021)
10.34756/GEOS.2021.17.38048

15. Дещеревская Н.О., Казанцев А.В., Донова М.В. Трансформация холевой кислоты психрофильными бактериями родов Psychrobacter и Arthrobacter. VII Пущинская школа-конференция "Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов" (6-9 декабря 2021 г.) Пущино, Сборник тезисов С. 226-228 (год публикации - 2021)
10.34756/GEOS.2021.17.38011

16. Лобастова Т.Г., Фокина В.В., Донова М.В. Конверсия холестерина термофильными актинобактериями VII Пущинская школа-конференция "Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов" (6-9 декабря 2021 г.) Пущино, Сборник тезисов С. 251-252 (год публикации - 2021)
10.34756/GEOS.2021.17.38026

17. Донова М.В., Ивашина Т.В., Довбня Д.В., Карпов М.В., Брагин Е.Ю., Стрижов Н.И. Инженерия микробных продуцентов ценных изопреноидных синтонов на основе актинобактерий рода Mycolicibacterium VII Пущинская школа-конференция "Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов" (6-9 декабря 2021 г.) Пущино, Сборник тезисов С. 140-141 (год публикации - 2021)
10.34756/GEOS.2021.17.37954

18. Текучева Д.Н., Фокина В.В., Николаева В.М., Шутов А.А., Карпов М.В., Донова М.В. Каскадная биоконверсия фитостерина в тестостерон штаммами Mycolicibacterium neoaurum ВКМ Ас-1815Д и Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д Микробиология, 2022, Т. 91, №3 (год публикации - 2022)

19. Вячеслав Коллеров, Марина Донова Ursodeoxycholic acid production by Gibberella zeae mutants AMB Express, 12 : 105 (год публикации - 2022)
10.1186/s13568-022-01446-2

20. Т.А. Тимакова, В.В. Фокина, Т.В. Бубнова, В.А. Немашкалов, М.В. Донова Optimization of growth conditions for the testosterone-producting Mycolicibacterium neoaurum strain Opera Med. Physiol., 9, 3, 98-104 (год публикации - 2022)
10.24412/2500-2295-2022-3-98-104

21. В.В. Фокина, М.В. Карпов, В.В. Коллеров, Е.Ю. Брагин, Л.О. Эпиктетов, А.В. Свиридов, А.В. Казанцев, А.А. Шутов, М.В. Донова Recombinant Extracellular Cholesterol Oxidase from Nocardioides simplex Biochemistry (Moscow), 2022, 87 (9), pp. 903-915 (год публикации - 2022)
10.1134/S0006297922090048

22. М.В. Донова Microbial Steroid Production Technologies: Current Trends and Prospects Microorganisms, 2022, 10, 53 (год публикации - 2022)
10.3390/microorganisms10010053

23. Д.Н. Текучева, В.М. Николаева, М.В. Карпов, Т.А. Тимакова, А.А. Шутов, М.В. Донова Bioproduction of testosterone from phytosterol by Mycolicibacterium neoaurum strains: “one-pot”, two modes Bioresources and Bioprocessing, 2022. 116. P. 2-14 (год публикации - 2022)
10.1186/s40643-022-00602-7

24. Бяков А., Карпов М., Стрижов Н., Донова М. Создание и характеристика Mycolicibacterium smegmatis mc2 155 с делециями в генах, кодирующих ферменты окисления стеринов WoS conferences (год публикации - 2022)

25. Лобастова Т., Фокина В., Позднякова-Филатова И., Тарлачков С., Донова М. Insight into Different Stages of Steroid Degradation in Thermophilic Saccharopolyspora hirsuta VKM Ac-666T Strain International Journal of Molecular Sciences (год публикации - 2022)

26. Коллеров В.В., Шутов А.А., Казанцев А.В., Донова М.В. Hydroxylation of pregnenolone and dehydroepianrosterone by zygomycete Backusella lamprospora VKM F-944: selective production of 7a-OH-DHEA Applied Microbiology and Biotechnology, 2022, 106(2), p. 535-548 (год публикации - 2022)
10.1007/s00253-021-11737-6

27. В.В. Коллеров, А.А. Шутов, М.В. Донова Selective microbial conversion of DHEA into 7α-ОН-DHEA Microbial Steroids - Methods and Protocols (2nd Edition) (год публикации - 2023)

28. А.В. Свиридов, М.В. Карпов, В.В. Фокина, М.В. Донова Cholesterol assay based on recombinant cholesterol oxidase, ABTS and horseradish peroxidase Microbial Steroids - Methods and Protocols (2nd Edition) (год публикации - 2023)

29. Д.В. Довбня, Т.В. Ивашина, С.М. Хомутов, А.А. Шутов, Н.О. Дещеревская, М.В. Донова Obtaining of 24-norchol-4-ene-3,22-dione from phytosterol with mutants of Mycolicibacterium neoaurum Microbial Steroids - Methods and Protocols (2nd Edition) (год публикации - 2023)

30. Д.В. Довбня, Е.Ю. Брагин, Т.В. Ивашина, М.В. Донова Draft Genome Sequence of Mycolicibacterium smegmatis VKM Ac-1171 contains full set of sterol catabolic genes Microbial Resource Announcement, 2022, e00772-22 (год публикации - 2022)
10.1128/mra.00772-22

31. М.В. Карпов, В.М. Николаева, В.В. Фокина, А.А. Шутов, А.В. Казанцев, Н.И. Стрижов, М.В. Донова Creation and Functional Analysis of Mycolicibacterium smegmatis Recombinant Strains Carrying the Bacillary Cytochromes CYP106A1 and CYP106A2 Genes Applied Biochemistry and Microbiology, 2022, Vol. 58, No. 9, pp. 1–11 (год публикации - 2022)
10.1134/S0003683822090058

32. Пошехонцева В.Ю., Стрижов Н.И., Сазонова О.И., Николаева В.М., Шутов А.А., Донова М.В. Создание и функциональный анализ рекомбинантных штаммов Escherichia coli, несущих ген мутантного цитохрома Р450 ВМ3 VIII Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов», Школа-конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Генетические технологии в микробиологии и микробное разнообразие»: сборник тезисов. М.: ГЕОС, 2022. 294 с., Материалы VIII Пущинской школы-конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов». – Пущино, 2022. – С. 191-193 (год публикации - 2022)
10.34756/GEOS.2022.17.38358

33. Фокина В.В., Карпов М.В., Коллеров В.В., Брагин Е.Ю., Эпиктетов Д.О., Шутов А.А., Свиридов А.В., Донова М.В. Рекомбинантная холестериноксидаза из Nocardioides simplex VIII Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов», Школа-конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Генетические технологии в микробиологии и микробное разнообразие»: сборник тезисов. М.: ГЕОС, 2022. 294 с., Материалы VIII Пущинской школы-конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов». – Пущино, 2022. – С. 209-211 (год публикации - 2022)
10.34756/GEOS.2022.17.38370

34. Яппаров Р.Р., Фокина В.В., Донова М.В. Ферментный препарат на основе клеток Nocardioides simplex для получения ценных 1(2)-дегидрированных 3-кетостероидов. VIII Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов», Школа-конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Генетические технологии в микробиологии и микробное разнообразие»: сборник тезисов. М.: ГЕОС, 2022. 294 с., Материалы XIII Пущинской школы-конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов». – Пущино, 2022. – С. 223-225 (год публикации - 2022)
10.34756/GEOS.2022.17.38378

35. Довбня Д.В., Брагин Е.Ю., Ивашина Т.В., Шутов А.А., Донова М.В. Стерин-деградирующая активность и геномная последовательность Mycolicibacterium smegmatis ВКМ Ac-1171. VIII Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов», Школа-конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Генетические технологии в микробиологии и микробное разнообразие»: сборник тезисов. М.: ГЕОС, 2022. 294 с., Материалы VIII Пущинской школы-конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов». – Пущино, 2022. – С. 126-128. (год публикации - 2022)
10.34756/GEOS.2022.17.38321

36. Хомутов С.М., Шутов А.А., Довбня Д.В., Донова М.В. Циклодекстрины в лакказном окислении стероидных спиртов:от ингибирования к синтезу. VIII Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов», Школа-конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Генетические технологии в микробиологии и микробное разнообразие»: сборник тезисов. М.: ГЕОС, 2022. 294 с., Материалы VIII Пущинской школы-конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов». – Пущино, 2022. – С. 276-278. (год публикации - 2022)
10.34756/GEOS.2022.17.38410

37. Коллеров В.В., Донова М.В. Протопластирование и мутагенез грибной культуры Gibberella zeae ВКМ F-2600: получение активных продуцентов урсодезоксихолевой кислоты. VIII Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов», Школа-конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Генетические технологии в микробиологии и микробное разнообразие»: сборник тезисов. М.: ГЕОС, 2022. 294 с., Материалы VIII Пущинской школы-конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов». – Пущино, 2022. – С. 246-248 (год публикации - 2022)
10.34756/GEOS.2022.17.38392

38. Лобастова Т.Г., Фокина В.В., Тарлачков С.В., Брагин Е.Ю., Донова М.В. Влияние температуры на экспрессию генов термофильного штамма Saccharopolyspora hirsuta ВКМ Ac-666Т при биоконверсии холестерина. VIII Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов», Школа-конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Генетические технологии в микробиологии и микробное разнообразие»: сборник тезисов. М.: ГЕОС, 2022. 294 с., Материалы VIII Пущинской школы-конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов». – Пущино, 2022. – С. 170-172 (год публикации - 2022)
10.34756/GEOS.2022.17.38345

39. Брагин Е.Ю., Довбня Д.В., Ивашина Т.В., Донова М.В. Draft genome sequence of soil isolate Mycolicibacterium fortuitum DVD-1301 Microbiology Resource Announcements, Microbiology Resource Announcements, 2023 Nov 9 (год публикации - 2023)
10.1128/MRA.00708-23

40. Коллеров В.В., Тарлачков С.В., Донова М.В. De novo transcriptome assembly of Curvularia sp. VKM F-3040, a promising steroid-modifying ascomycete. Microbiology Resource Announcements, 2023. Volume 12. Issue 11 (год публикации - 2023)
10.1128/MRA.00663-23

41. Донова М.В. Current Trends and Perspectives in Microbial Bioconversions of Steroids Methods in Molecular Biology, Humana Press, New-York; Series: Microbial Steroids Methods and Protocols, Edited by Carlos Barreiro and José-Luis Barredo, 2023:2704:3-21 (год публикации - 2023)
10.1007/978-1-0716-3385-4_1

42. Донова М.В. Метаболическая инженерия микробных продуцентов для промышленной биотехнологии: получение изопреноидов для фармацевтики и медицины Сборник тезисов 4-го Российского микробиологического конгресса, г. Томск, Сборник тезисов 4-го Российского микробиологического конгресса, г. Томск, стр. 114-115 (год публикации - 2023)

43. В.Ю. Пошехонцева, Н.И. Стрижов, М.В. Карпов, В.М. Николаева, А.В. Казанцев, О.И. Сазонова, А.А. Шутов, М.В. Донова Экспрессия синтетического гена cyp102A1-LG23 и функциональный анализ рекомбинантного цитохрома P450 BM3-LG23 в актинобактериях Mycolicibacterium smegmatis Биохимия, 2023, том 88, вып. 9, с. 1631–1641 (год публикации - 2023)
10.31857/S0320972523090142

44. С.Р. Фуфаева, Д.В. Довбня, Т.В. Ивашина, А.А. Шутов, М.В. Донова Reconstruction of steroid 1(2)-dehydrogenation system from Nocardioides simplex VKM Ac-2033D in Mycolicibacterium hosts Microorganisms, 2023, 11, 2720 (год публикации - 2023)
10.3390/microorganisms11112720

45. Хомутов С.М., Шутов А.А., Аверин А.Д., Довбня Д.В., Донова М.В. Novel approach for downstream processing of phytosterol bioconversion Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2023; 98: 2455–2461 (год публикации - 2023)
10.1002/jctb.7471

46. В.В. Коллеров, C.В. Тарлачков, А.А. Шутов, М.В. Донова Экспрессия гена P450-монооксигеназы гриба Curvularia sp. в бактериях E. coli и подтверждение функции 7-гидроксилирования Микробиология (год публикации - 2023)

47. Текучева Д.Н., Карпов М.В., Фокина В.В., Тимакова Т.А., Шутов А.А., Донова М.В. Одностадийная биотрансформация фитостерина в тестостерон рекомбинантными штаммами Mycolicibacterium neoaurum Микробиология (год публикации - 2023)

48. Коллеров В.В., Тарлачков С.В., Шутов А.А., Донова М.В. Идентификация гена и функциональная характеристика новой грибной стероидной 7-гидроксилазы штамма Curvularia sp. ВКМ F-3040 Сборник тезисов 4-го Российского микробиологического конгресса, г. Томск, Сборник тезисов 4-го Российского микробиологического конгресса, г. Томск, стр. 95 (год публикации - 2023)

49. Эпиктетов Д.О., Карпов М.В., Донова М.В. Изучение активности ферредоксинов и ферредоксинредуктаз актинобактерий M. smegmatis Сборник тезисов 4-го Российского микробиологического конгресса, г. Томск, Сборник тезисов 4-го Российского микробиологического конгресса, г. Томск, стр. 165-166 (год публикации - 2023)

50. Карпов М.В., Брагин Е.Ю., Сафаргалеева А.В., Донова М.В. Влияние экспрессии мутантных генов репрессора KSTR на потребление стеринов актинобактериями Smеgmatis Сборник тезисов 4-го Российского микробиологического конгресса, г. Томск, Сборник тезисов 4-го Российского микробиологического конгресса, г. Томск, стр. 47 (год публикации - 2023)

51. Текучева Д.Н., Карпов М.В., Фокина В.В., Тимакова Т.И., Шутов А.А., Донова М.В. Одностадийная биотрансформация фитостерина в тестостерон миколицибактериальными штаммами Сборник тезисов 4-го Российского микробиологического конгресса, г. Томск, Сборник тезисов 4-го Российского микробиологического конгресса, г. Томск, стр. 160-161 (год публикации - 2023)

52. Д.О. Эпиктетов, М.В. Карпов, М.В. Донова Идентификация переноса электронов в системе ферредоксинов и ферредоксинредуктаз Mycobacterium smegmatis Микробиология (год публикации - 2023)

53. Коллеров В.В., Тарлачков С.В., Шутов А.А., Донова М.В. Новая грибная стероид-7-гидроксилаза: идентификация гена и функциональная экспрессия в Pichia pastoris Сборник тезисов IX Всероссийской пущинской конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов», Пущино, 5-7 декабря 2023 г, Сборник тезисов конференции, С. 102-103 (год публикации - 2023)
10.34759/GEOS.2023.17.38731

54. Лобастова Т.Г., Донова М.В. Конверсия холевой кислоты термофильными актинобактериями рода Saccharopolyspora Сборник тезисов IX Всероссийской пущинской конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов», Пущино, 5-7 декабря 2023 г, Сборник тезисов конференции, С. 110-112 (год публикации - 2023)
10.34756/GEOS.2023.17.38737

55. Текучева Д.Н., Карпов М.В., Фокина В.В., Тимакова Т.И., Шутов А.А., Донова М.В. Применение рекомбинантных штаммов Mycobacterium neoaurum в одностадийной трансформации фитостерина в тестостерон Сборник тезисов IX Всероссийской пущинской конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов», Пущино, 5-7 декабря 2023, Сборник тезисов конференции, С 118-119. (год публикации - 2023)
10.34756/GEOS.2023.17.38741

56. Фуфаева С.Р., Довбня Д.В., Шутов А.А., Ивашина Т.В., Донова М.В. Активность гетерологичной стероидной дегидрогеназы KstD2 в различных организмах-хозяевах Сборник тезисов IX Всероссийской пущинской конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов», Пущино, 5-7 декабря 2023 г, Сборник тезисов конференции, С. 121-123 (год публикации - 2023)
10.34756/GEOS.2023.17.38743

57. Донова М.В. Микробные биотехнологии: Проблемы и перспективы Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний: Материалы III Всероссийской конференции с международным участием, Сборник тезисов III Всероссийской конференции с международным участием 3–7 июля 2023 г., Улан-Удэ – Байкальск «ЭКОЛОГИЯ И ГЕОХИМИЧЕСКАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ МЕСТООБИТАНИЙ», С. 39040 (год публикации - 2023)
10.53954/9785604859865

58. Коллеров В.В., Тарлачков С.В., Шутов А.А., Казанцев А.В., Донова М.В. Identification of a gene encoding a new fungal steroid 7-hydroxylase and its functional characterization in Pichia pastoris yeast International Journal of Molecular Sciences, Int J Mol Sci, 2023, 24, 17256-17273 (год публикации - 2023)
10.3390/ijms242417256

59. Бяков А.А., Карпов М.В., Стрижов Н.И., Шутов А.А., Донова М.В. Биоконверсия холестерина рекомбинантными штаммами Mycolicibacterium smegmatis с мутациями в генах окисления боковой цепи. VIII Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов», Школа-конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Генетические технологии в микробиологии и микробное разнообразие»: сборник тезисов. М.: ГЕОС, 2022. 294 с., Материалы VIII Пущинской школы-конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов». – Пущино, 2022. – С. 114-115 (год публикации - 2022)
10.34756/GEOS.2022.17.38313

60. Коллеров В.В., Шутов А.А., Донова М.В. Биотехнологический способ получения 3b,7b-гидроксиандрост-5ен-17она из 3b-гидроксиандрост-5ен-17она ФИПС, Заявка на патент №2024122025 (год публикации - 2024)

61. Текучева Д.Н., Донова М.В., Пошехонцева В.Ю. Способ получения прегненолона из холестерина с применением рекомбинантной метилобактерии Methylorubrum extorquens NS11 ВКМ 3857Д, гетерологически экспрессирующей ферменты крупного рогатого скота – цитохром Р450scc (CYP11A1), адренодоксидредуктаза и адренодоксид ФИПС, Заявка на патент №2024122026 (год публикации - 2024)

62. Текучева Д.Н. Донова М.В., Пошехонцева В.Ю., Карпов М.В., Стрижов Н.И. Генетическая конструкция, обеспечивающая синтез белков холестерингидроксилазной С20/22-лиазной системы млекопитающих в метилобактериях, и новый рекомбинантный штамм метилобактерий Methylorubrum extorquens NS11 ВКМ 3857Д – продуцент прегненолона ФИПС, Заявка на патент №2024122027 (год публикации - 2024)

63. Бяков А.А., Карпов М.В., Стрижов Н.И., Шутов А.А., Донова М.В Инженерия Mycolicibacterium smegmatis для продукции прогестерона VII Съезд ВОГиС 2024, Саратов. Саратовский национальный исследовательский государственный университет им. Н. Г. Чернышевского. Сборник тезисов конференции, VII Съезд ВОГиС 2024, Саратов. Саратовский национальный исследовательский государственный университет им. Н. Г. Чернышевского. Сборник тезисов конференции. С. 344. (год публикации - 2024)

64. В. В. Коллеров, C. В. Тарлачков, А. А. Шутов, М. В. Донова Экспрессия гена Р450 монооксигеназы гриба Curvularia sp. в бактериях Esherichia coli и подтверждение функции 7-гидроксилирования Микробиология Pleiades Publishing, Ltd., Микробиология, 2024, том 93, № 2, с. 189–192 (год публикации - 2024)
10.31857/S0026365624020168

65. Д.О. Эпиктетов, М.В. Карпов, М.В. Донова Идентификация переноса электронов в системе ферредоксинов и ферредоксинредуктаз Mycolicibacterium smegmatis Микробиология, Микробиология 2024, том 93, №2, с. 133-138 (год публикации - 2024)
10.31857/S0026365624020062

66. Карпов М.В., Сафаргалеева А.В., Донова М.В. Модуляция катаболизма холестерина экспрессией мутантных генов, кодирующих транскрипционный репрессора KstR, в актинобактериях Mycolicibacterium smegmatis Сборник тезисов X Всероссийской Пущинской конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов», Сборник тезисов X Всероссийской Пущинской конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов» С. 129 (год публикации - 2024)

67. Виктория Фокина, Татьяна Лобастова, Сергей Тарлачков, Андрей Шутов, Алексей Казанцев, Марина Донова Degradation of C19-steroids and effect of androstenedione on gene expression in Nocardioides simplex Current Microbiology (год публикации - 2024)

68. Михаил Карпов, Николай Стрижов, Людмила Новикова, Татьяна Лобастова, Сергей Хомутов, Андрей Шутов, Алексей Казанцев, Марина Донова Pregnenolone and progesterone production from natural sterols using recombinant strain of Mycolicibacterium smegmatis mc2 155 expressing mammalian steroidogenesis system Microbial Cell Factories, 2024 Apr 9;23(1):105 (год публикации - 2024)
10.1186/s12934-024-02385-2

69. Брагин Е.Ю., Фокина В.В., Донова М.В Поиск генов катаболизма стероидов и автоматизация работы программы BLAST+ Новосибирск, ИЦиГ СО РАН, 2024, Сборник тезисов 14-й Международной Мультиконференции «Биоинформатика регуляции и структуры геномов / системная биология» (Bioinformatics of Genome Regulation and Structure/Systems Biology, BGRS/SB-2024) г. Новосибирск. С. 1446-1449. (год публикации - 2024)
10.18699/bgrs2024-8.3-01

70. Карпов М.В., Эпиктетов Д.О., Бяков А.А., Донова М.В. Сверхэкспрессия генов, кодирующих стерин-26-гидроксилазы, в миколицибактериях Сборник тезисов X Всероссийской Пущинской конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов», Сборник тезисов X Всероссийской Пущинской конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов» С. 130 (год публикации - 2024)

71. Вячеслав В. Коллеров, Татьяна А. Тимакова, Андрей А. Шутов, Марина В. Донова Boldenone and testosterone production from phytosterol via one-pot cascade biotransformations Journal of Fungi, Journal of Fungi, 2024, 10, 830 (год публикации - 2024)
10.3390/jof10120830

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В ходе выполнения проекта в отчетном периоде получены следующие приоритетные результаты: Созданы новые штаммы миколицибактерий с улучшенными биокаталитическими возможностями, а также штаммы, продуцирующие стероиды с частично окисленной боковой цепью с полезной функционализацией. Так, получен мутантный штамм Mycolicibacterium smegmatis ΔkstDΔltp2-chsH2, продуцирующий 9α-гидрокси-20-метил-3-оксопрегна-4,17-диен-26-оевую кислоту в качестве основного продукта из фитостерина, а также мутант с инактивированным геном ретроальдолазы Δltp4, продуцирующий 27-норхолест-4-ен-3,24-дион – необычный С26 стероид с С-24 оксофункционализацией. Ранее о получении таких соединений микробиологическим путем не сообщалось. - С использованием мутантного штамма M. neoaurum B3805ΔkstDΔhsd4A разработан эффективный метод получения ценного стероидного синтона – 20-гидроксиметилпрегн-4-ен-3-она (ГМП, также известного как BA и BNC), который востребован на мировом рынке в качестве стартового соединения в синтезе важнейшего гормона – прогестерона, а также – в современных схемах синтеза кортикостероидов. Метод обеспечивает получение ГМП с выходом свыше 96% (мольн.) при высоких (до 80 г/л) нагрузках субстрата – фитостерина. При этом показана эффективность биоконверсии фитостеринов как таллового, так и соевого происхождения. Метод масштабирован до уровня лабораторных ферментеров. Разработана эффективная схема выделения и очистки целевого продукта с получением кристаллического ГМП с чистотой свыше 98%. Таким образом, разработана биотехнология полного цикла получения ценного стероидного синтона - ГМП, по эффективности превосходящая мировые аналоги. - При использовании созданного нами ранее в ходе выполнения данного проекта рекомбинантного штамма M. smegmatis BD BM3-LG-23, экспрессирующего уникальный мутантный цитохром P450 (LG23) из Bacillus megaterium (Priestia megaterium) разработан метод получения 7β-гидроксиандростендиона – синтона, востребованного при получении ценных желчных кислот их неживотных источников. - Впервые установлена возможность осуществления микробиологическим путем гидроксилирования C19-стероидов в положениях С1β и дигидроксилирования в положениях С1β и С7β. Образование соответствующих гидроксистероидов выявлено при использовании рекомбинантного штамма M. smegmatis BD, экспрессирующего мутантный цитохром P450 BM3-LG-23. - Изучена способность полученных нами ранее рекомбинантных штаммов E. coli BL21(DE3) и M. smegmatis BD, гетерологически экспрессирующих другой мутантный цитохром CYP107D1-QAG из Streptomyces antibioticus, к окислению литохолевой кислоты (ЛХК). В отличие от рекомбинантов E.coli, рекомбинанты миколицибактерий гидроксилировали ЛХК в положении С7 с образованием смеси изомеров – хенодеоксихолевой и урсодеоксихолевой кислот, образующихся в эквимолярных количествах, что свидетельствует о региоселективности гидроксилирования, но не его стереоселективности. - Созданы дрожжевые рекомбинанты Pichia pastoris-pPICZA-P450cur (syn. Komagataella phaffii), экспрессирующие ген новой, ранее открытой нами, уникальной грибной P450-монооксигеназы (P450cur). Полученные рекомбинанты с одиночным геном P450cur эффективно гидроксилировали андростадиендион и дегидроэпиандростерон в положении С7β и превосходили по скорости и эффективности гидроксилирования стероидов ранее полученные нами рекомбинанты P.pastoris, коэкспрессирующие наряду с геном P450cur его нативного редокс-партнера - грибную цитохромP450 редуктазу. Результаты свидетельствуют о наличии у P.pastoris собственной цитохром P450-редуктазы, способной выступать в роли редокс-партнера гетерологичного цитохрома P450cur. На основе созданного нами рекомбинантного штамма P. pastoris GS115-pPICZA-P450cur разработан эффективный биотехнологический синтез ценного гидроксистероида 7β-ОН-АДД, обеспечивающего мольный выход целевого стероида до 67% при нагрузке стероидного субстрата АДД до 1000 мг/л. - Изучены особенности окисления холестерина (ХС) при С26 ранее созданными штаммами M.smegmatis mc2 155 со сверхэкспрессией генов, кодирующих компоненты стерин-26-гидроксилазных систем. Сконструированные миколицибактерии, накапливали до 5,5 моль% 26-гидроксихолестерина (26OH-ХС) в процессе биотрансформации 1 г/л ХС. Образующийся на ранних этапах биоконверсии 26OH-ХС подвергался окислению при С3 собственными 3-гидроксистероиддегидрогеназами хозяина с образованием С26-гидроксистероидов с 3-кето-4-ен-конфигурацией. Стерин-26-монооксигеназы, синтезируемые в клетках миколицибактерий, катализировали дальнейшее окисление гидроксистероидов до соответствующих С26-кислот, инициируя деградацию боковой цепи. - Изучена возможность ингибирования окисления алифатической боковой цепи и стероидного ядра путем модификации транскрипционного фактора KstR, контролирующего каскад реакций стероидного катаболизма. С помощью in silico анализа в активном центре KstR выявлены аминокислоты, ответственные за связывание стероидного индуктора и участвующие в конформационном ответе на присутствие лиганда. С помощью сконструированных олигонуклеотидных праймеров с хромосомной матрицы M. smegmatis проведена амплификация гена kstR и получены его мутантные варианты, кодирующие аминокислотные замены в активном центре лиганд-связывающего домена. Создан набор плазмидных конструкций для клонирования мутантных kstR в E.coli и их экспрессии в миколицибактериях. С их помощью получены штаммы M. smegmatis, в которых осуществлена экспрессия переносимых генов с использованием нативного промотора Pkstr и индуцибельного ацетамидазного промотора Pami. Выявлены мутации, способствующие замедлению окислительной деградации холестерина, наиболее отчетливо выраженному при использовании промотора Pami. Результаты опубликованы в рецензируемых научных изданиях, в т.ч. первого квартиля, представлены на научных конференциях, поданы 5 патентных заявок

Публикации

Возможность практического использования результатов
Комплексное решение вышеуказанных фундаментальных и научно-практических задач позволит создать новые штаммы – продуценты для промышленной микробиологии и прототипы биотехнологий нового поколения для многоцелевого производства изопреноидов стероидного и инданового ряда из возобновляемого природного сырья - природных стеринов.