Механизмы поддержания стабильности 3D-генома и технологии его направленного изменения для решения фундаментальных и прикладных задач.

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 21-64-00001

НазваниеМеханизмы поддержания стабильности 3D-генома и технологии его направленного изменения для решения фундаментальных и прикладных задач.

Руководитель Разин Сергей Владимирович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук , г Москва

Конкурс №56 - Конкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по поручениям (указаниям) Президента Российской Федерации» (генетические исследования)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-201 - Структурная, функциональная и эволюционная геномика

Ключевые слова хроматин, хроматиновый домен, транскрипция, регуляция экспрессии генов, 3D-геном, энхансер, промотор, клеточное ядро, доменная организация генома, коммуникация между промотором и энхансером, РНК-полимераза, эпигеном

Код ГРНТИ34.15.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
В основе развития различных патологий, включая онкологические, сердечно-сосудистые, нейродегенеративные и психические заболевания, часто лежат нарушения в молекулярных системах регуляции экспрессии генов и поддержании стабильности генома. Накопленные за последние десятилетия данные о структуре и динамике клеточного ядра не позволяют рассматривать эти системы только как набор белковых факторов, регулирующих транскрипцию и репарацию ДНК. Помимо базовых механизмов транскрипции и репарации, большое влияние на регуляцию экспрессии генов и поддержание стабильности генома оказывают существующие в ядре локальные контексты, обусловленные эпигенетическими условиями, динамикой внутриядерных компартментов и пространственной организацией генома (3D-геном). Настоящий проект будет посвящен комплексному анализу влияния различных внутриядерных условий, в первую очередь 3D-организации генома, на регуляцию экспрессии генов и поддержание стабильности генома. Важной как для фундаментальных, так и для трансляционных исследований задачей проекта будет разработка технологий направленного изменения 3D-генома, основанная на модуляции локальных внутриядерных условий (контекстов). Настоящий комплексный проект будет реализовываться в рамках трех концептуально связанных направлений: (1) разработка технологий направленного изменения 3D-генома и эпигенома эукариотической клетки, (2) исследование 3D-генома и базовых механизмов транскрипции для установления мишеней, ответственных за развитие патологий, и (3) изучение роли ядерных компартментов в поддержании стабильности 3D-генома. В рамках разработки новых технологий направленного изменения 3D-генома и эпигенома клетки особое внимание будет уделено технологиям, позволяющим исследовать причинно-следственные связи между изменениями пространственной организации генома и модуляцией его функциональной активности, а также технологиям, обладающим потенциалом к эпигенетической коррекции/компенсации геномных дефектов, связанных с развитием различных патологий. Реализация второго направления проекта позволит не только получить оригинальные данные о базовых механизмах транскрипции, а также об участии хроматин-модифицирующих ферментов и пространственной организации генома в регуляции экспрессии генов и процессах дифференцировки клеток, но и приведет к разработке платформы для идентификации низкомолекулярных соединений, способных модулировать структуру 3D-генома эукариотической клетки. Реализация третьего направления проекта, посвященного роли ядерных компартментов в поддержании стабильности 3D-генома позволит существенно расширить наши представления о механизмах формирования субъядерных компартментов и их роли в регуляции процессов транскрипции и репарации ДНК. Особое внимание будет уделено также механизмам взаимовлияния транскрипции и репарации ДНК в зависимости от локальных внутриядерных условий/контекстов. Все составные части проекта являются принципиально новыми и не имеют прямых аналогов в современной науке. Помимо того, что каждая из обозначенных выше задач является оригинальной, научная актуальность и новизна проекта в целом обусловлена тем, что он носит системный характер и направлен на расширение, а возможно и частичный пересмотр современных представлений об организации транскрипции и репарации ДНК в ядре эукариотической клетки, а также о взаимосвязи этих процессов (подробнее см. п.п. 4.2 и 4.3).

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Величко А.К., Овсянникова Н., Петрова Н.В., Лужин А.В., Воробьева М., Гавриков А.С., Мишин А.С., Киреев И.И., Разин С.В., Кантидзе О.Л. Treacle and TOPBP1 control replication stress response in the nucleolus. Journal of Cell Biology, том 220. выпуск 8, e202008085 (год публикации - 2021)
10.1083/jcb.202008085

2. Гераськина О., Малюченко Н., Студитский В., Кошкина Д., Феофанов А. Microscopic Analyses of Liquid-Liquid Phase Separation Induced by Linker Histone H1.0 International Journal of Biomedicine, том 11, доп. 1, с. S21-22 (год публикации - 2021)
10.21103/IJBM.11.Suppl_1.P24

3. Кос П.И., Галицына А.А., Ульянов С.В., Гельфанд М.С., Разин С.В., Чертович А.В. Perspectives for the reconstruction of 3D chromatin conformation using single cell Hi-C data PLoS Computational Biology, том 17, выпуск 11, e1009546 (год публикации - 2021)
10.1371/journal.pcbi.1009546

4. Яровая О.В., Юдинкова Е.С., Величко А.К., Разин С.В. Manipulation of Cellular Processes via Nucleolus Hijaking in the Course of Viral Infection in Mammals Cells, том 10, выпуск 7, статья 1597 (год публикации - 2021)
10.3390/cells10071597

5. Разин С.В., Юдинкова Е.С., Kantidze O.L., Яровая О.В. Co-Regulated Genes and Gene Clusters Genes, том 12, выпуск 6, статья 907 (год публикации - 2021)
10.3390/genes12060907

6. Гаврилов А.А., Султанов Р.И., Магнитов М.Д., Галицина А.А., Дашинимаев Э.Б., Либерман Виден Э., Разин С.В. RedChIP identifies noncoding RNAs associated with genomic sites occupied by Polycomb and CTCF proteins Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS), 119 (1):e2116222119 (год публикации - 2022)

7. Разин С.В., Жигалова И.В., Кантидзе О.Л. ДОМЕННАЯ МОДЕЛЬ ОРГАНИЗАЦИИ ЭУКАРИОТИЧЕСКОГО ГЕНОМА: ОТ ЗАКРЕПЛЕННЫХ НА ЯДЕРНОМ МАТРИКСЕ ПЕТЕЛЬ ДНК К ТАДам Биохимия, том 87, выпуск 7, стр. 946-961 (год публикации - 2022)
10.31857/S0320972522070090

8. Ковина А.П., Петрова Н.В., Комков Д.С., Дашинимаев Э.В., Разин С.В. Regulatory systems of chicken alpha-globin gene domain suppress bidirectional transcription Biochimica et biophysica acta. Gene regulatory mechanisms, 1865(5):194850 (год публикации - 2022)
10.1016/j.bbagrm.2022.194850

9. Разин С.В., Кантидзе О.Л. The twisted path of the 3D genome: where does it lead? Trends in Biochemical Sciences (TIBS), 47(9):736-744 (год публикации - 2022)
10.1016/j.tibs.2022.04.006

10. Яровая О.В., Ульянов С.В., Юдинкова Е.С., Разин С.В. СЕГРЕГАЦИЯ КЛАСТЕРОВ α- И β-ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ В ХОДЕ ЭВОЛЮЦИИ ПОЗВОНОЧНЫХ – СЛУЧАЙНОСТЬ ИЛИ ЗАКОНОМЕРНОСТЬ? Биохимия / Biochemistry (Mosc), 87, (9): 1301 – 1317 (год публикации - 2022)
10.31857/S0320972522090093

11. Ильин А.А., Колонковая А.Д., Голова А.В., Шлема В.В., Оленина О.М., Ненашева В.В., Абрамов Я.А., Котов А.А., Максимов Д.А., Лактионов П.П., Пиндюрин А.В., Галицина А.А., Храмеева Е.Е., Гельфанд М.С., Разин С.В., Шевелев Ю.Я. Comparison of genome architecture at two stages of male germline cell differentiation in Drosophila Nucleic Acids Research, 50(6):3203-3225 (год публикации - 2022)
10.1093/nar/gkac109

12. Малюченко Н., Кошкина Д., Коровина А., Студитский М., Феофанов А. Interactions of PARP1 Inhibitors with PARP1-Nucleosome Complexes Cells (MDPI), 11, 3343 (год публикации - 2022)
10.3390/cells11213343

13. Кошкина Д., Малюченко Н., Котова Е., Лис А., Коровина А., Феофанов А., Студитский В. Enhanced PARP-1 binding and remodeling of nucleosomes flanked by linker hairpins FEBS OPEN BIO, 12 (Supl S1), 259 (год публикации - 2022)
10.1002/2211-5463.13440

14. Величко А.К. Петрова Н.В., Лужин А.В., Кантидзе О.Л. РЕПЛИКАТИВНЫЙ СТРЕСС В ЯДРЫШКЕ III Объединенный научный форум физиологов, биохимиков и молекулярных биологов (Сочи, Дагомыс, 3–8 октября 2021), Научные труды. Издательство Перо, том 2, стр 11 (год публикации - 2022)

15. Гаврилов А.А., Султанов Р.И., Галицына А.А., Магнитов М.Д., Разин С.В. КОМБИНАЦИЯ ИММУНОПРЕЦИПИТАЦИИ ХРОМАТИНА И РНК–ДНК ЛИГИРОВАНИЯ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ НЕКОДИРУЮЩИХ РНК, АССОЦИИРОВАННЫХ С УЧАСТКАМИ ГЕНОМА, ОККУПИРОВАННЫМИ БЕЛКОМ ИНТЕРЕСА III Объединенный научный форум физиологов, биохимиков и молекулярных биологов (Сочи, Дагомыс, 3–8 октября 2021), Научные труды. Издательство Перо, том 2, стр. 9 (год публикации - 2022)

16. Малюченко Н., Нилов Д., Кошкина Д., Лис А., Гераськина О., Коровина А., Феофанов А., Студитский В. Nucleosome reorganization by PARP-1 Bioinformatics of genome regulation and structure/systems biology (BGRS/SB-2022). The Thirteenth International Multiconference. Abstracts., P. 1005 (год публикации - 2022)

17. Калабушева Е.П., Штомпель А.С., Риппа А.Л., Ульянов С.В., Разин С.В., Воротеляк Е.А. A Kaleidoscope of Keratin Gene Expression and the Mosaic of Its Regulatory Mechanisms International Journal of Molecular Sciences, 24, 5603 (год публикации - 2023)
10.3390/ijms24065603

18. Кобец В.Ф., Ульянов С.В., Галицина А.А., Доронин С.А., Михалева Е.А., Гельфанд М.С., Шевелев Ю.Я., Разин С.В., Храмеева Е.Е. HiConfidence: a novel approach uncovering the biological signal in Hi-C data affected by technical biases Briefings in Bioinformatics, 24(2):bbad044 (год публикации - 2023)
10.1093/bib/bbad044

19. Тюкачева Е.А., Ульянов С.В., Карпухина А., Разин С.В., Васецкий Е.С. 3D genome alterations and editing in pathology Molecular Therapy, 31(4):924-933 (год публикации - 2023)
10.1016/j.ymthe.2023.02.005

20. Герасимова Н.С., Пестов Н.А., Студицкий В.М. Role of Histone Tails and Single Strand DNA Breaks in Nucleosomal Arrest of RNA Polymerase Int. J. Mol. Sci., 24(3):2295 (год публикации - 2023)
10.3390/ijms24032295

21. Петрунина Н.А., Шторк А.С., Лукина М.М., Цветков В.Б., Ходарович Ю.М., Феофанов А.В., Мойсенович А.М., Максимов Е.Г., Шипунова В.О., Зацепин Т.С., Богомазова А.Н., Шендер В.О., Аралов А.В., Лагарькова М.А., Варижук А.М. Ratiometric i-Motif-Based Sensor for Precise Long-Term Monitoring of pH Micro Alterations in the Nucleoplasm and Interchromatin Granules. ACS Sensors, 8(2):619-629 (год публикации - 2023)
10.1021/acssensors.2c01813

22. ГЕРАСИМОВА Н.С., ФЕОФАНОВ А.В., СТУДИТСКИЙ В.М. Analysis of transcription through nucleosome using FRET-based techniques reveals the variability of spatial structures in elongation complexes with the same RNA product length Biophysical Reviews, 15:1425-1861. S1.10. (год публикации - 2023)
10.1007/s12551-023-01150-w

23. Герасимова Н.С., Пестов Н.А., Студитский В.М. Histone tails and single strand DNA breaks stabilize intranucleosomal DNA loops during transcription through a nucleosome Biophysical Reviews, 15:1425-1861. S1.43 (год публикации - 2023)
10.1007/s12551-023-01150-w

24. Захарова В.В., Магнитов М.Д., Дель Маэстро Л., Ульянов С.В., Глентис А., Яник Б., Виллиарт А., Капуцина А., Демидов О., Джулио В., Васецкий Е.С., Меже Р.М., Пиелите М., Разин С.В., Аит-Си-Али С. SETDB1 fuels the lung cancer phenotype by modulating epigenome, 3D genome organization and chromatin mechanical properties Nucleic Acids Research, 50(8):4389-4413. (год публикации - 2022)
10.1093/nar/gkac234

25. Магнитов М.Д., Гараев А.К., Тяхт А.В., Ульянов С.В., Разин С.В. Pentad: a tool for distance-dependent analysis of Hi-C interactions within and between chromatin compartments BMC Bioinformatics, 23(1):116 (год публикации - 2022)
10.1186/s12859-022-04654-6

26. Гао М., Вней М., Розенблат М., Рисле А.О., Гебхардт А., Хасс Х., Гурьянова Л., Ямпольский Л.Ю., Ульянов С.В., Тиммер Ж., Онищук Д. Pluripotency factors determine gene expression repertoire at zygotic genome activation Nature Communications, 13(1):788 (год публикации - 2022)
10.1038/s41467-022-28434-1

27. Герасимова Н.С., Пестов Н.А., Студитский В.М Роль N-концевых доменов гистонов при транскрипции нуклеосом с однонитевыми разрывами ДНК Успехи молекулярной онкологии, Том 10. № 4. Приложение. С. 13–14. (год публикации - 2023)

28. Доронин С.А., Ильин А.А., Кононкова А.Д., Соловьев М.А., Оленкина О.М., Ненашева В.В., Михалева Е.А., Лавров С.А., Иванникова А.Ю. Симонов Р.А., Федотова А.А., Храмеева Е.Е., Ульянов С.В., Разин С.В., Шевелев Ю.Я. Nucleoporin Elys attaches peripheral chromatin to the nuclear pores in interphase nuclei Communications biology, 7 (1), 783 (год публикации - 2024)
10.1038/s42003-024-06495-w

29. Голов А.К., Гаврилов А.А. Cohesin Complex: Structure and Principles of Interaction with DNA Biochemistry (Mosc) , 89 (4), 585-600 (год публикации - 2024)
10.1134/S0006297924040011

30. Голов А.К., Гаврилов А.А. Cohesin-Dependent Loop Extrusion: Molecular Mechanics and Role in Cell Physiology Biochemistry (Mosc), 89(4), 601-625 (год публикации - 2024)
10.1134/S0006297924040023

31. Голов А.К., Гаврилов А.А., Каплан Н., Разин С.В. A genome-wide nucleosome-resolution map of promoter-centered interactions in human cells corroborates the enhancer-promoter looping model ELIFE (год публикации - 2024)
10.7554/eLife.91596.2.sa4

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Продемонстрировано, что дифференцировка индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека в кератиноциты сопровождается значительной реорганизацией пространственной структуры локуса кератиновых генов. Подготовка к активации гена кератина-5 в этих клетках проходит на фоне реализации двух альтернативных пространственных конфигураций локуса, в одной из которых имеет место взаимодействие двух суперэнхаснеров локуса, а в другой ген кератина-5 контактирует с одним из этих суперэнхаснеров. При этом в заметном числе клеток образуется и тройственный комплекс, в котором одновременно оказываются сближены в пространстве оба суперэнхансера и ген кератина-5. Эти преобразования сопровождаются изменениями в профиле связывания в пределах локуса главного архитектурного белка хроматина – CTCF. По всей видимости, это является отражением глобальной перестройки регуляторной системы всего геномного домена, конкретные элементы которой могут быть детектированы путём определения точек связывания ключевых активаторов, таких как р63. Продемонстрировано, что привлечением ряда транскрипционных факторов, в том числе, мастер-регулятора кератиноцитной дифференцировки KLF4 к промотору гена кератина-1 в клетках, не экспрессирующих э тот ген, не приводит к активации промотора. По всей видимости, это связано с тем, что ген кератина-1 находится в протяжённом неактивном домене, где транскрипция репрессирована посредством белков системы Поликомб. Методами электрофореза в нативном геле и spFRET-микроскопии установлено, что тройные комплексы нуклеосома:PARP1:dCas9 (dCas9 - неактивная форма эндонуклеазы Cas9) образуются эффективно независимо от области таргетирования гРНК: как к области вблизи границы нуклеосомы, так и к области вблизи диады нуклеосомы. В тройных комплексах связывание PARP1 ограничивает подвижность супервитков ДНК, вызываемую взаимодействием нуклеосом с dCas9, a dCas9 в свою очередь препятствует структурным изменениям в нуклеосомах, вызываемых ферментом PARP1. Как результат, вне зависимости от области таргетирования dCas9, в тройных комплексах сохраняется конформация нуклеосомной ДНК, характерная для свободных нуклеосом. В ходе экспериментов по транскрипции одиночных нуклеосом in vitro изучена возможная роль первичной структуры матричной ДНК и концевых неструктурированных доменов гистонов в формировании нуклеосомного барьера для транскрипции при приближении РНКП к границе нуклеосомной ДНК. Разработан новый экспериментальный протокол для анализа промотор-энхансерных контактов и впервые в мире построена карта контактов промоторов и энхансеров с разрешением в одну нуклеосому (200 п.н.). Продемонстрировано, что в клетках линии K562 не менее 65% активных энхансеров устанавливают пространственный контакт с контролируемыми ими промоторами. Продемонстрировано, что более половины энхансер-промоторных контактов формируется без участия инсуляторного белка CTCF. При этом контактирующие с промоторами удаленные участки генома (подтвержденные и неподтвержденные энхансеры) обогащены связанными факторами ремоделирования хроматина и гистонацетилазой p300 Изучены молекулярные механизмы структурной организации фибриллярных центров (FC) ядрышка, а также роль белка Treacle в поддержании транскрипции рибосомных генов, процессинга рРНК и репарации рибосомной ДНК. Подтверждено, что Treacle является ключевым каркасным белком FC, играя центральную роль в их структурной интеграции. Деплеция Treacle приводила к разрушению четко различимых структур FC и плотного фибриллярного компонента (DFC), что сопровождалось снижением уровня транскрипции рРНК и нарушением процессинга 5′ внешнего транскрибируемого спейсера (5′-ETS). Это свидетельствует о важности Treacle как для транскрипции рибосомных генов, так и для ранних этапов процессинга рРНК. С использованием полногеномного ChIP-seq анализа показано, что Treacle, в отличие от своего партнера UBF, специфически связывается исключительно с кодирующей зоной рДНК, не проявляя значительного связывания с Pol II-ассоциированными участками генома. Также продемонстроировано, что Treacle формирует платформу для привлечения белков репарационного комплекса, таких как Nbs-1, при повреждениях рДНК. Транслокация Nbs-1 в ядрышко и его ассоциация с рДНК оказались полностью зависимыми от Treacle и его партнера TOPBP1, тогда как снижение уровня Nbs-1 не влияло на локализацию TOPBP1. Методом гель-шифт анализа определена способность белка PARP1 взаимодействовать с элонгационным комплексом, включающим РНКП и нуклеосому с целой и поврежденной ДНК. На основе всех полученных данных предложена модель действия белка PARP1 при транскрипции нуклеосом с однонитевыми разрывами ДНК. Проведено исследование способности полинуклеосом формировать полидисперсную фазу при взаимодействии с PARP1. Изучена обратимость процесса и определена роль факторов, влияющих на формирование дисперсной фазы, таких как ионный состав среды, поли-АДФ рибозилирование, присутствие рибонуклеотидтрифосфатов и мононуклеосомных включений.

Публикации

Возможность практического использования результатов
В результате реализации проекта продемонстрирована принципиальная возможность создания молекулярных инструментов для редактирования 3D посредством привлечения к выбранным местам генома укороченной формы белка CTCF слитой c с неактивной формой нуклеазы Cas9 (dCas9). Продемонстрировано, что хроматин, содержащий вариантный гистон H2AZ и гистон H3, ацетилированный по лизину К56 обладает повышенной доступностью для нуклеазы Cas9 и ее неактивной формы Сas9. Это открывает возможность сфокусировать действие данных инструментов редактирования генома и эпигенома на регуляторных элементах, для которых характерно присутствие вариантного гистона H2AZ и гистона Н3, ацетилированного по лизину К56. Перечисленные результаты открывают возможность разработки новых стратегий редактирования генома и эпигенома в том числе в интересах практической медицины. Разработка нового высокочувствительного протокола картирования пространственных контактов между энхансерами и промоторами важно для решения вопроса о том, в каких случаях реконфигурация генома может быть использована для изменения уровня транскрипции представляющих интерес для практической медицины генов, в том числе онкогенов и антионкогенов. Идентификация регуляторных элементов локуса кератиновых генов человека и раскрытие роли изменений пространственной организации локуса в контроле активации индивидуальных кератиновых генов по ходу дифференцировки кератиноцитов открывает перспективы модуляции экспрессии кератиновых генов посредством направленного изменения 3D генома и эпигенома Полученная нами карта высокого разрешения энхансер-промотрных контактов в эритроидных клетках человека является важным информационным ресурсом, которые может быть использован при разработке различных стратегий коррекции заболеваний, связанных с нарушением экспрессии глобиновых генов (таласемий). Раскрытие ключевой роли белка Treacle в формировании транскрипционных фабрик, осуществляющих синтез рибосомной РНК и в координации клеточного цикла с ответом на различные стрессы позволяет рассматривать этот белок в качестве мишени для противораковой терапии. Раскрытие механизма участия PARP в транскрипции поврежденной ДНК представляется важным для совершенствования существующих стратегий противораковой терапии, включающих подавление активности PARP