Доклинические испытания протокола превентивной генной терапии для повышения жизнеспособности нейронов головного мозга при угрозе ишемического инсульта и генной терапии сдерживания гибели нейронов в первые часы возникновения инсульта у мини-свиней

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 19-75-10030

НазваниеДоклинические испытания протокола превентивной генной терапии для повышения жизнеспособности нейронов головного мозга при угрозе ишемического инсульта и генной терапии сдерживания гибели нейронов в первые часы возникновения инсульта у мини-свиней

Руководитель Сафиуллов Зуфар Зуфарович, Кандидат медицинских наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Казанский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации , Республика Татарстан (Татарстан)

Конкурс №41 - Конкурс 2019 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-401 - Молекулярная и клеточная медицина

Ключевые слова аденовирусный вектор, сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), глиальный нейротрофический фактор (GDNF), нейрональная молекула клеточной адгезии (NCAM), превентивная генная терапия, мононуклеарные клетки пуповины крови человека, лейкоконцентрат, средняя мозговая артерия, ишемический инсульт головного мозга, крыса, мини-свинья.

Код ГРНТИ34.03.37

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Ишемический инсульт головного мозга является одной из самых актуальных проблем, как в фундаментальной, так и практической медицине. Ежегодно в России регистрируется более 450 тыс. инсультов, при этом 70–80% пациентов, выживших после инсульта, становятся инвалидами, что накладывает особые социальные и экономические обязательства на государство. К сожалению, в настоящее время в медицинской практике отсутствует эффективная терапия, направленная на сдерживание гибели нейронов в зоне ишемического повреждения мозга. В связи с этим, существует необходимость поиска новых современных методов лечения и профилактики ишемического инсульта. Большинство работ по поиску методов преодоления последствий ишемического инсульта выполнено в эксперименте с целью терапии инсульта после его возникновения. При этом недостаточно представлены исследования, направленные на повышение жизнеспособности нейронов при угрозе инсульта. Более того, результаты, полученные в экспериментах на мелких животных (грызунах) не могут быть прямо транслированы на пациента, поэтому, требуется проведение доклинических исследований на крупных животных, анатомические особенности строения, а также физиологические и биохимические характеристики которых приближены к человеку. Среди известных модельных организмов мини-свиньи считаются наиболее оптимальными животными для доклинических испытаний. Целью заявленного проекта является разработка метода превентивной генной терапии для повышения жизнеспособности нейронов головного мозга при угрозе ишемического инсульта и генной терапии для сдерживания гибели нейронов в первые часы возникновения инсульта в моделях на мини-свиньях. Заявленное исследование является продолжением проекта, подержанного грантом РНФ «Клеточно-опосредованная генная терапия ишемического инсульта головного мозга» № 17-75-10053 (2018-2019 г). В ходе выполнения данного проекта нами впервые был разработан и применен генно-клеточный препарат для сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте в моделях на крысах. Установлено, что генетически модифицированные мононуклеарные клетки крови пуповины, сверхэкспрессирующие рекомбинантные молекулы-стимуляторы нейрорегенерации (сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), глиальный нейротрофический фактор (GDNF) и нейрональную молекулу клеточной адгезии (NCAM)) оказывают положительный эффект на ремоделирование мозга в условиях ишемии. Интратекальная инфузия генно-клеточного препарата через 4 часа после моделирования инсульта способствует: (1) лучшей сохранности ткани головного мозга, снижению уровня экспрессии молекул клеточного стресса (Hsp70) и количества клеток, эксперссирующих проапоптозные белки (Caspase3); (2) снижению количества астроцитов и клеток микроглии, ответственных за астроглиоз; (3) увеличению численности олигодендроцитов, способствующих миелинизации нервных отростков; и (4) повышению экспрессии синаптических белков (PSD95 и Synaptophysin), отражающих восстановление функциональной активности мозга [Sokolov, 2018]. По результатам исследования получен патент на изобретение РФ «Средство для сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга и способ клеточно-опосредованной генной терапии ишемического инсульта головного мозга средством сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга» № 2676701. На первом этапе заявленного проекта в продолжение нашего предыдущего исследования будет разработан и испытан протокол превентивной генной терапии ишемического инсульта в моделях на крысах. Для превентивной генной терапии предполагается интратекальное введение одновременно трех аденовирусных векторов, несущих терапевтические гены сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), глиального нейротрофического фактора (GDNF) и нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM) или генетически модифицированных мононуклеарных клеток крови пуповины человека, продуцирующих рекомбинантные молекулы VEGF, GDNF и NCAM, крысам до моделирования инсульта. Ожидается, что рекомбинантные терапевтические молекулы повысят жизнеспособность нейронов в условиях ишемии. Действующим началом препарата являются VEGF и GDNF. Обе молекулы являются нейропротекторами с хорошо изученными механизмами сдерживания вступления клеток в апоптоз. Кроме того, VEGF играет важную роль в восстановлении микроциркуляции в зоне ишемии мозга. Экспрессия нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM) в лейкоцитах усилит миграцию и хоуминг генетически модифицированных клеток в нервную ткань реципиента, что обеспечит адресную доставку терапевтических генов в область ишемического повреждения мозга. На втором этапе исследования впервые для клеточно-опосредованной генной терапии инсульта будет применен генетически модифицированный лейкоконцентрат, полученный из крови мини-свиньи и рекомбинантных генов, кодирующих VEGF, GDNF и NCAM. Мини-свинье после моделирования инсульта в период «терапевтического окна» будет выполнена внутривенная аутоинфузия генетически модифицированного лейкоконцентрата. Новизна поставленной задачи состоит в выборе клеточного носителя терапевтических генов, а именно лейкоцитарной фракции периферической крови, которая может быть использована для аутотрансплантации (модель персонифицированной терапии). Таким образом, нами впервые будет испытан генетически модифицированный лейкоконцентрат, полученный из периферической крови и содержащий генетический материал, обеспечивающий эндогенную временную продукцию нейротрофических факторов, для сдерживания гибели нейронов в первые часы возникновения инсульта. Неоспоримым преимуществом данного генно-клеточного препарата является его простата получения из периферической крови и генетических векторов и использования для доставки в организм реципиента терапевтических генов путем аутотрансплантации. На третьем этапе исследования впервые будет разработан протокол превентивной генной терапии ишемического инсульта с помощью генетически модифицированного лейкоконцентрата в моделях на мини-свиньях. В настоящем исследовании будет разработан и испытан протокол аутотрансплантации генетически модифицированного лейкоконцентрата мини-свиньям до моделирования инсульта. Ранее на трансгенных мышах с моделью бокового амиотрофического склероза нами было установлено, что генетически модифицированные мононуклеарные клетки крови пуповины человека после внутривенной инфузии способны проникать через гемато-энцефалический барьер, мигрировать в очаг нейродегенерации и продуцировать рекомбинантные нейротрофические факторы [Сафиуллов З.З., 2015]. Эти результаты дают основание полагать, что генетически модифицированные лейкоциты мини-свиньи также способны проникать через гемато-энцефалический барьер, а рекомбинантные молекулы VEGF, GDNF и NCAM, продуцируемые собственными лейкоцитами мини-свиньи, повысят жизнеспособность нейронов, что окажет положительное влияние на нейроплатичность мозга после моделирования ишемического инсульта у животных. Для оценки терапевтической эффективности клеточно-опосредованной генной терапии инсульта будут использованы поведенческие тесты, гистологические и молекулярные методы исследования морфо-функционального восстановления головного мозга крыс и мини-свиней с моделью ишемического инсульта. Заявленные способы клеточно-опосредованной генной терапии ишемического инсульта и превентивной генной терапии при угрозе ишемического инсульта в моделях на мини-свиньях являются оригинальными и ни в одной из лабораторий мира экспериментально не проверяются.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ