КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

---

Номер проекта 18-74-00050

НазваниеCRISPR-Cas9-опосредованная регуляция транскрипции эндогенных генов с помощью ближнего инфракрасного света

Руководитель Омелина Евгения Сергеевна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук , Новосибирская обл

Конкурс №29 - Конкурс 2018 года по мероприятию «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-209 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Ключевые слова оптогенетика, CRISPR/Cas9, регуляция транскрипции, генная терапия

Код ГРНТИ34.57.00

---

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

---

Аннотация
Транскрипция генов является важнейшим процессом в развитии и жизнедеятельности всех живых организмов. В настоящее время существует множество методов для регуляции транскрипции различных экзогенных репортерных конструкций. Также в последнее время появились подходы, с помощью которых можно контролировать транскрипцию эндогенных генов. Одним из таких подходов является система CRISPR (clustered regularly interspaced palindromic repeats; короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами)-Cas (CRISPR-associated; CRISPR-ассоциированный белок). С помощью sgRNA (single-guide RNA; единая направляющая РНК) каталитически неактивная форма белка Cas9 (dCas9) из бактерии Streptococcus pyogenes может связываться с определенной последовательностью генома, которая комплементарна первым 20 нуклеотидам sgRNA и расположена близко к мотиву вида NGG (protospacer-adjacent motif, PAM). Было показано, что dCas9, слитый с транскрипционным активаторным доменом, обеспечивает активацию экспрессии интересующих эндогенных генов (Cheng et al., 2013). Однако такой подход не дает возможности пространственно-временной регуляции, тогда как для понимания сложных биологических сетей, а также для практического применения в области генной терапии необходимо создание такой системы, которая обеспечивает регуляцию генов точно во времени и пространстве. Данный проект предполагает совмещение dCas9 с оптогенетической парой RpBphP1–QPAS1 из Rhodopseudomonas palustris (Redchuk et al., 2017, 2018), контролируемой ближним инфракрасным (ИК) светом (~740 нм). Комбинация этих двух систем позволит запускать или подавлять транскрипцию интересующего гена (или нескольких генов) с помощью ближнего ИК света. Оптогенетические системы выгодно отличаются от методов, контролируемых введением химических агентов (например, тетрациклина, рапамицина), т.к. они нетоксичны и не зависят от скорости диффузии химического агента и фармакокинетики. Предлагаемая оптогенетическая система также обеспечивает не только пространственную регуляцию экспрессии, но и временную регуляцию, в т.ч. высокую скорость переключения между активным и неактивным состояниями. Разработанная ранее оптогенетическая система для регуляции транскрипции эндогенных генов с помощью dCas9 не применялась к работе на целых организмах (Nihongaki et al., 2015). Во многом это связано с тем, что эта система контролируется синим светом, проницаемость которого в живые ткани сильно ограничена по сравнению с ближним ИК светом (Рисунок 1Г). Данный проект предполагает создание свето-индуцируемой системы, способной как активировать, так и ингибировать транскрипцию интересующих генов применительно к модели целого организма. В первой части проекта система будет протестирована на культивируемых клетках дрозофилы и непосредственно на дрозофиле. Также будет показана возможность направленной свето-индуцируемой дифференцировки мультипотентных первичных эмбриональных клеток дрозофилы в клетки мышечной и нейрональной тканей. Вторая часть проекта посвящена одному из возможных генно-терапевтических применений системы, а именно лечению диабета I типа у NOD (non-obese diabetic) мышей. Этот процесс предполагает свето-индуцируемую активацию генов Pdx1 (Pancreatic and duodenal homeobox 1), MafA и Ngn3 (neurogenin 3) для перепрограммирования SOX9+ клеток печени в инсулин-продуцирующие клетки. Таким образом, данный проект предполагает разработку оптогенетической системы, с помощью которой можно неинвазивно контролировать физиологические и поведенческие процессы живых организмов, в том числе млекопитающих. Предлагаемый подход может быть использован в области генной терапии, медицины, геномных технологий, генетической инженерии и биотехнологий. Список литературы Cheng, A.W., Wang, H., Yang, H., Shi, L., Katz, Y., Theunissen, T.W., Rangarajan, S., Shivalila, C.S., Dadon, D.B., and Jaenisch, R. (2013). Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Res. 23, 1163–1171. Nihongaki, Y., Yamamoto, S., Kawano, F., Suzuki, H., and Sato, M. (2015). CRISPR-Cas9-based photoactivatable transcription system. Chem Biol. 22(2): 169-174. Redchuk, T.A., Omelina, E.S., Chernov, K.G., Verkhusha, V.V. (2017) Near-infrared optogenetic pair for protein regulation and spectral multiplexing. Nature chemical biology.13 (6), 633-639. Redchuk, T.A., Karasev, M.M., Omelina, E.S., Verkhusha, V.V. (2018) Near-infrared light-controlled gene expression and protein targeting in neurons and non-neuronal cells. Chem Bio Chem. DOI: 10.1002/cbic.201700642.

---

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

---