КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 23-73-10158

НазваниеМногослойные фотополимеризуемые органо-неорганические гидрогелевые системы с флуоресцентным откликом и контролируемым рилизингом ингибиторов кворум сенсинга для регенерации обширных ран

РуководительГржегоржевский Кирилл Валентинович, Кандидат химических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина", Свердловская обл

Период выполнения при поддержке РНФ 07.2023 - 06.2026 

Конкурс№85 - Конкурс 2023 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 03 - Химия и науки о материалах, 03-602 - Химия новых органических и гибридных функциональных материалов

Ключевые словатемплат, гидрогели, рилизинг, ингибиторы кворум сенсинга, полиоксометаллат, флуоресцентный отклик, гибридные материалы, регенерация

Код ГРНТИ31.15.37

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Проект направлен на создание синтетических подходов к дизайну новых умных-материалов (smart-materials) для задач регенерации кожных покровов и пролонгированной доставки (рилизинга) целевых биоактивных молекул: ингибиторов кворум сенсинга (ИКС, QS-ингибитор) и местных анестетиков. Предлагаемый к реализации проект состоит из трех ключевых программных модулей. Первый модуль посвящен декорированию структуры катионных и неионогенных ИКС посредством введения функциональных групп, влияющих на фундаментальные процессы молекулярного распознавания на мембранах бактериальных клеток. Проявляя сродство к целевым рецепторам, ИКС нарушают химическую коммуникации внутри клеточной колонии и не позволяют сформировать бактериальную пленку – один из главных факторов возникновения больничных суперинфекций. Второй модуль связан с разработкой подходов к получению фотополимеризуемых биосовместимых гидрогелевых систем на основе сеток полиакриламида (ПААм). Ключевой особенностью создаваемых гидрогелевых систем будет их многослойность. При общей толщине порядка 5 мм, за счет последовательной фотополимеризации в присутствии витамина В2 (фотоинициатор) предлагается создание сэндвич-структуры из 3-4 слоев. Первый слой (гидрогель #1) состоит из ПААм гидрогеля с ПОМ {Мо132} (молекулярного темплата), предварительно ассоциированного с аналгетиком, антибиотиком (в катионной форме, тетрациклин и др.) и катионным ИКС, а также включает поверхностную хитозановую пленку (толщиной несколько мономолекулярных слоев и состоящую из чередующихся слоев хитозана и макроаниона {Мо132}), обращенную к ране. Следующий слой (гидрогель #2) может состоять только из ПААм или дополнительно включать в структуру ПОМ для контроля размера сетки. Данный слой выполняет тормозящую функцию, предотвращая преждевременный рилизинг компонентов из следующего слоя (гидрогель #3). Гидрогель третьего слоя по своей структуре повторяет гидрогель #1, однако, содержит менее сильный анестетик (или меньшую дозу), антибиотик (с меньшей концентрацией, чем в 1 слое; использование здесь антисептика нежелательно, т.к. на поздних стадиях это мешает грануляции регенерирующей ткани), а также ИКС в меньшей дозе, что призвано обеспечить плавный переход к следующему этапу регенерации тканей, когда вероятность развития бактериальных инфекций уже снижена, а болевые ощущения выражены слабее. Верхний, четвертый слой (гидрогель #4) представляет собой ПААм сетку, с включенными наночастицами TiO2, введение которых служит защите от светового воздействия на рану и обеспечивает защиту от контаминации за счет фотоиндуцированной окислительной деструкции микроорганизмов и вирусов, адсорбировавшихся на внешней поверхности гидрогеля. В качестве базовых модельных анестетиков будут использованы актуальные сегодня препараты (в катионной форме) типа лидокаин, ультракаин, бупивакаин, а на роль антибиотика выбран – тетрациклин (в катионной форме). После отработки методик получения многослойных гидрогелевых систем с заданными параметрами рилизинга модельных соединений, будут проведены работы третьего модуля. Данный блок исследования посвящен изучению биологической активности синтезированных в ходе выполнения работ первого модуля ИКС на бактериальных культурах (Staphylococcus и др.) и на модельных организмах (рыбы Danio rerio, анализ общего биологического эффекта). На основе проведенных скрининговых экспериментов в условиях in vivo будут выбраны наиболее перспективные ИКС для включения их в состав многослойных гидрогелевых систем. Кроме того, будет изучен регенеративный эффект получаемых многослойных гидрогелевых систем в экспериментах по культивированию фибробластов in vitro и in vivo на лабораторных животных (мыши). Таким образом, решаемая в проекте задача по решению проблемы персонифицированной медицины в области регенерации кожных и слизистых покровов является в полной мере актуальной, а предлагаемые синтетические подходы обладают достаточным уровнем научной новизны.

Ожидаемые результаты
Ожидаемые в ходе реализации проекта результаты следует разделить на несколько блоков. Первый блок связан с разработкой фундаментальных подходов к дизайну супрамолекулярной структуры фотополимеризуемых полиакриламидных сеток посредством введения наноразмерного неорганического темплата {Mo132}, который представляет собой многозарядный макроанион, способный к рН-зависимой деструкции (интенсификация рилизинга при рН=7.4), кроме того, такой темплат может быть удален из сетки, оставляя поры соответствующего размера (3 нм). В результате введение полиоксометаллата (ПОМ) {Mo132}, предварительно ассоциированного с биоактивными препаратами в катионной форме (анестетик, антибиотик, QS-ингибитор), в структуру гидрогеля позволяет создавать системы пролонгированного рилизинга через универсальный протокол, практически вне зависимости от природы доставляемого лекарства. Такая «универсальность» служит практической значимости и доступности технологии изготовления гидрогелей. Использование концепции многослойности также служит этой цели, так как позволяет независимо настраивать целевые свойства каждого слоя, исходя из его специфической нагрузки: предотвращение развития резистентных бактериальных инфекций, обезболивание, защита от контаминаций и механического повреждения. Возможность тонкой настройки супрамолекулярной структуры гидрогеля в каждом слое имеет большое значение с научной точки зрения, так как за частую формирование трехмерной полимерной сетки носит статистический характер, что нивелирует специфичность взаимодействий с живыми тканями организма каждого из компонентов гидрогеля. Результаты второго блока относятся с синтетической органической химии и связаны с декорированием структуры ингибиторов кворум сенсинга (ИКС, QS-ингибитор) в катионной и неионогенной формах. Фокус проводимых в рамках проекта исследований направлен не на антибиотики, а на ИКС, как на крайне перспективную и актуальную альтернативу борьбы с бактериальными инфекциями взамен стратегии поиска все более мощных антибиотиков. Обнаруженный в конце 20-века эффект влияния коммуникации между бактериальными клетками на процесс формирования защитной биопленки, обеспечивающей резистентность штаммов даже к сильным антибиотикам, позволил говорить о принципиально новом подходе в борьбе с суперинфекциями. В ходе реализации проекта планируется провести синтез новых ИКС на основе базовых структур с целью установления фундаментальной связи «структура-свойства» посредством экспериментов in vitro на бактериальных колониях. Таким образом, важность ожидаемых результатов от реализации данного этапа проекта связана с возможностью выявления ключевого структурного фрагмента в молекулах ИКС, определяющего аффинность молекул ингибитора к мембранным рецепторам различных бактериальных штаммов. В свою очередь, это является критической точкой роста для создания ИКС следующего поколения. Кроме того, концепцию ингибирования межклеточной коммуникации можно прогностически транслировать на процессы разрушения макрофагального (макрофаги 2-типа) защитного окружения раковых клеток, открывая возможность для формирования нормального иммунного ответа. В рамках синтетического блока также ожидается получение тио-производных ксантеновых красителей, которые можно ковалентно иммобилизовать в полимерной сетке гидрогеля. В этом контексте введение ПОМ {Mo132} носит дополнительный смысл, так как позволяет сформировать систему с обратной связью. А именно, как нами было ранее показано, на поверхности {Mo132} происходит тушение флуоресценции молекул родамина-Б, которая возвращается на исходный уровень при деструкции ПОМ. Таким образом, комбинирование в структуре гибридного гидрогеля кеплератов {Mo132} и флуоресцентных красителей позволит оценить остаточную концентрацию препаратов, ассоциированных с ПОМ, по мере процесса рилизинга. Данный результат имеет большое значение, так как позволяет проводить индивидуальный мониторинг фармакокинетики у пациента и определить момент замены регенерирующей повязки. Следующим важным результатом проекта по созданию многослойных гидрогелей являются подходы к управлению функциональной нагрузкой терминальных слоев, обращенных к ране (гидрогель #1) или к внешней поверхности повязки (гидрогель #4). На сегодняшний день существует определенное количество работ, посвященных созданию гибридных слоев на основе полиоксометаллатов и катионных полиэлектролитов, однако, среди них нет работ, посвященных интерфейсам «гидрогель/живая ткань». Введение Кеплерата в гидрогель #1 позволяет создать на его поверхности тонкий адгезивный слой из хитозана, который связан с полиакриламидной сеткой через макроанионы {Mo132}. Когда необходимо удалить регенерирующую повязку, то достаточно будет воздействовать на место контакта с раной слабощелочным раствором (рН в районе 8.4) и хитозановый слой, в который уже встроились клеточные структуры, отделиться от полиакриламидной основы из-за деструкции ПОМ. В результате смена повязки будет малоинвазивной и не будет негативно сказываться на динамике регенерации раны. Кроме того, в рамках синтетических подходов планируется привить неионогенные ИКС к хитозановому слою через лабильные имидные связи (pH-cleavable), основания Шиффа, которые способны к обратимому кислотному гидролизу в области рН=6, что соответствует кислотности раны на первых этапах ее регенерации. В результате интенсивность процесса рилизинга таких ИКС будет напрямую связана со степенью заживления раны, уменьшаясь по мере формирования кожного покрова. Последнее можно отнести к задачам тераностики – подхода, который лежит в основе ряда современных концепций персонифицированной медицины. Возвращаясь к терминальным слоям гидрогелевой системы, предлагаемый дизайн верхнего слоя (гидрогель #4) предполагает введение диоксида титана, который коммерчески доступен в форме наночастиц (P25). Создание такого композитного слоя служит не только улучшению механической прочности системы, но и позволит обеспечивать дополнительную защиту от заражения вирусными или бактериальными инфекциями посредством окислительной деструкции контаминирующих агентов свободно-радикальными формами кислорода на поверхности TiO2. На ряду с передовыми подходами борьбы с бактериальными инфекциями и способом предотвращения контаминации раны, сама концепция создания многослойных гидрогелей также заслуживает внимания. Создание такой сэндвич-структуры будет проводиться последовательно в разборной кювете слой за слоем. Такой процесс возможен благодаря фотополимеризации акриламида и сшивающего агента в присутствии фотоинициатора – рибофлавина (витамин B2) под действием мягкого УФ (365-400 нм). Все компоненты указанной смеси являются полностью биосовместимыми. При этом, возможно как формирование структуры полиакриламидной сетки in situ, т.е. при совместной полимеризации акриламида и сшивающего агента, так и введение в систему полиакриламида заданной молекулярной массы, что позволит варьировать эластичность гидрогеля. В дополнение к синтетическому аспекту в проекте планируется получить результаты по общей биологической активности синтезированных ИКС на модельных животных – рыбах Danio Rerio. Наряду с результатами скрининговых экспериментов по активности ИКС на бактериальных штаммах и опытами по культивированию фибробластов человека на синтезируемых гидрогелях, это позволит создать многослойную гидрогелевую регенерирующую повязку с большим потенциалом для реального использования на практике. Таким образом, в результате послойного дизайна будет получена легко-сменяемая гидрогелевая повязка, способная стимулировать рост новых кожных покровов, сопровождая процесс регенерации рилизингом ИКС, антибиотика и местных анестетиков (уже применяющихся в клинической практике), а также обеспечивая плавный переход к поздним этапам заживления, индикацию времени замены (флуоресцентный отклик) и протекторную функцию от контаминаций и механических повреждений. С одной стороны, подобные системы относятся к передовым средствам персонифицированной медицины, с другой стороны, несмотря на высокую наукоемкость предлагаемых подходов, позволяют использовать простые технологические решения для производства и масштабирования реальных изделий. В совокупности с фундаментальной составляющей проекта, к которой относится темплатный дизайн супрамолекулярной структуры гидрогеля, создание комплементарного окружения в полимерной сетке для гостевых молекул (ИКС, антибиотик, анестетик), и поиск связи «структура-свойства» новых ИКС, ожидаемые результаты соответствуют международному уровню исследований в указанных областях и будут востребованы и актуальны как для научных работников, так для специалистов из реального сектора экономики. Возможность практического использования ожидаемых результатов проекта имеет большое значение для реализации социально-значимой стратегии по внедрению средств персонифицированной медицины и поиску более эффективных способов борьбы с суперинфекциями.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В ходе выполнения проекта по созданию многослойных гидрогелевых раневых повязок с функцией пролонгированного рилизинга биоактивных компонентов (ингибиторов кворум сенсинга (QS), антибиотиков и анестетиков) были проведены исследования, которые можно разделить на три смысловых блока. Первый связан с разработкой синтетических подходов к направленной модификации структуры ингибиторов кворум сенсинга (QS-ингибиторов). В рамках работ первого блока нам удалось успешно реализовать две модификации структуры берберина посредством перевода его в тетрагидрокси-форму и введения нитро-группы. Кроме этого, были получены производные лекарственных препаратов адамантанового ряда (мемантина и римантадина), которые имеют жесткий трехмерный каркас, в отличие от более планарной молекулы берберина, что позволит в будущем построить связь между ингибиторной активностью соединений и их молекулярной структурой. Дополнительно нами получены (би)пиридиновые производные противомикробного препарата «Орнидазол», что также служит одной из задач проекта по формированию банка соединений с различной структурой, обладающих потенциальной QS-ингибирующей активностью, с целью как формулирования фундаментальных подходов к направленному усилению вышеуказанной ингибирующей функции, так и для их последующего включения в состав гидрогелевых регенерирующих повязок. Часть из вышеизложенных результатов опубликованы в Журнале Общей Химии и в журнале «Известия АН. Серия химическая». Помимо синтетических молекул в качестве QS-ингибиторов нами рассматриваются природные соединения, в частности, антоцианы. Природным сырьем для их извлечения может служить сорт черного риса «Южная ночь», выведенный российскими селекционерами. Используя методы хроматографического анализа, совмещенного с масс-спектрометрическим анализом фракций, нами были оптимизированы условия экстракции антоцианинов и определен состав экстракта, который, в зависимости от типа смеси вода-этанол был обогащен пеонидином и цианидином, или еще содержал в значительных количествах пеларгонидин. Последний был выбран нами в качестве референсного соединения и его синтез проводится отдельно, чтобы получить данные о его QS-ингибирующей активности в дегликозилированной форме. Второй блок исследований направлен на создание гибридных органо-неорганических гидрогелей, содержащих нанокластерный полиоксометаллат (ПОМ) кеплератного типа {Mo132}, введение которого служит настройке желаемой супрамолекулярной структуры материала и обеспечивает рН-зависимы рилизинг биоактивных компонентов системы, ассоциированных с ПОМ. Нами установлена связь между составом полимеризуемой смеси, содержащей акриламид, бифункциональный линкер, ПОМ и полиакриламид (ПААм) заданной молекулярной массы, и механическими свойствами получаемого под действием УФ-излучения гидрогеля. Для решения этой задачи по оригинальной методике фотополимеризации нами были синтезированы ПААм различной молекулярной массы (1.6-10.5 МДа) и изучено его взаимодействие с ПОМ {Mo132}, в результате чего был обнаружен ранее неописанный в таких системах эффект неньютоновского поведения. Данный эффект играет одну из ключевых ролей при формировании заданной супрамолекулярной структуры гидрогеля. Нами было показано, что введение ПААм различной молекулярной массы позволяет варьировать модуль упругости гидрогеля (6-15 кПа) и размер пор (4-7 нм), что критически важно для контроля механотрансдукции фибробластов в месте контакта с регенерирующей повязкой и для обеспечения необходимой скорости рилизинга компонентов геля в рану. Для придания гидрогелю способности к флуоресцентному отклику была предложена концепция введения в его состав катионного красителя ксантенового ряда, родамин-Б (РдБ), ковалентно связанного с макромолекулами полимера, чтобы не допустить его рилизинга. В результате с применением клик-реакций был получен полимер ПААм-РдБ, в котором степень модификации составила 1 РдБ на 1000 звеньев АА. Благодаря предложенной нами методики очистки удалось с высокой эффективностью отделить немодифицированный ПААм от ПААм-РдБ. Исследования фотофизических характеристик синтезированного ПААм-РдБ позволили обнаружить рН-зависимый термообратимый переход из закрытой спироформы (лактам, бесцветная форма) в открытую, которая обладает характерным окрашиванием и флуоресценцией. Данное явление имеет самостоятельную ценность в контексте возможного создания на основе ПААм-РдБ пассивных температурных меток. С целью повышения контроля над молекулярной структурой гидрогеля нами проведены исследования по направленной ковалентной модификации поверхности ПОМ {Mo132} молекулами стеариновой кислоты через кремнийорганический линкер по оригинальной методике. Полученные конъюгаты были использованы в роли супрамолекулярных синтонов при создании микрогеля, стабилизированного катионами кальция и содержащего анионный модельный краситель – эриохром черный Т. Полученные результаты подтвердили возможность рН-зависимого рилизинга данного красителя из структуры микрогеля, что приводило к ее необратимой деградации. Результаты исследования опубликованы в журнале ACS Applied Materials & Interfaces. Третий блок исследований связан с биологическими аспектами проекта. В рамках этого блока нами выполнены первичные эксперименты по анализу эффективности образования биопленок тремя бактериальными штаммами: Escherichia coli, Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка). Последний штамм показал наибольшую активность в образовании биопленок и был выбран для дальнейших экспериментов, так как имеет высокую актуальность с точки зрения реальной патогенности в медицинских учреждениях. Для формирования итоговой оценки QS-ингибирующей активности анализируемых соединений, в частности, производных берберина, подготовлены образцы для проведение микроскопического исследования формируемых биопленок методами оптической микроскопии и сканирующей электронной микроскопии. Учитывая высокую молекулярную специфичность ингибиторов, с целью установления предполагаемого механизма действия выбраны расчетные методы и определены белковые мишени для проведения докинга синтезированных производных берберина in silico. С опережением плана исследований нами проведены первичные эксперименты по общей токсичности берберина на модельных животных – рыбах Danio Rerio. В результате было обнаружено, что при дозе 1000 мг/л наблюдается почти 100% смертность как для мальков (7-9 дней), так и для взрослых особей (5-6 месяцев). При дозах 100 и 500 мг/л токсикологического действия для взрослых особей не обнаружено. Кроме того, в течение 2 часов наблюдений не обнаружено изменение в поведенческой активности, признаков атаксии не наблюдается. Через 24 и 48 часов после начала воздействия не выявлено внешних (поведенческих и патологических) изменений у экспериментальных животных. С целью изучения биосовместимости получаемых гидрогелей нами проведены опыты по оценке жизнеспособности клеток линии НЕР2. Установлена методологическая ошибка при использовании МТТ-теста и показано, что корректно жизнеспособность клеточной линии позволяет установить использование трипанового синего для окрашивания трипсинизированных клеток с последующим анализом среды с помощью счетчика клеток. Достоверно показано, что полученные гидрогели не приводят к клеточной гибели. Сформулированы методологические основы для изучения биосовместимости на линии клеток VERO эпителия почки зеленой африканской мартышки. Таким образом, резюмируя вышесказанное, можно заключить, что проект достиг ожидаемых результатов по итогам выполнения работ первого года – были сформированы ключевые фундаментальные и методологические подходы к дизайну структуры гидрогелей, создан стартовый банк QS-ингибиторов и осуществлена проверка работоспособности основной концепции проекта. Полученные результаты позволяют перейти к следующим этапам программы исследований для создания многослойных гидрогелевых композиций с функцией флуоресцентного отклика и рН-зависимого рилизинга биоактивных соединений для регенерации живых тканей.

 

Публикации

1. А. Деникаев, Ю. Кузнецова, А. Быков, К. Белова, П. Абрамов, Н. Москаленко, Е. Скорб, К. Гржегоржевский Keplerate {Mo132}–Stearic Acid Conjugates: Supramolecular Synthons for the Design of Dye-Loaded Nanovesicles, Langmuir–Schaefer Films, and Infochemical Applications ACS Applied Materials & Interfaces, ACS Appl. Mater. Interfaces 2024, 16, 6, 7430–7443 (год публикации - 2024) https://doi.org/10.1021/acsami.3c16374

2. Е. А. Кудряшова, М. И. Валиева, Н. В. Словеснова, А. В. Болотова, Ю. М. Сайфутдинова, С. Е. Ватолина, И. Л. Никонов, К. В. Гржегоржевский, Д. С. Копчук, Г. В. Зырянов, В. Л. Русинов Синтез (би)пиридиновых производных орнидазола Журнал Известия Академии Наук Серия Химическая, - (год публикации - 2024)

3. М.О. Тонкушина, И.Д. Гагарин, А.А. Гусейнова, П.А. Абрамов, М.Н. Соколов, В.С. Коренев, С.А. Петров, А.А. Остроушко, В.И. Пряхина, К.Г. Белова, К.А. Терещенко, Г.О. Охотников, А.А. Ермошин, К.В. Гржегоржевский Molecular recognition on the multi-sites binding surface of the Keplerate {Mo72Fe30} giving the supramolecular texturing and modulating the function of guest molecules -, - (год публикации - 2024)

4. Я.К. Штайц, E.Д. Ладин, Н.В. Словеснова, К.Д. Красноперова, Д.С. Копчук, Г.В. Зырянов, В.Л. Русинов СИНТЕЗ НОВЫХ ПЕРСПЕКТИВНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ КАНДИДАТОВ – ПРОИЗВОДНЫХ МЕМАНТИНА И РИМАНТАДИНА Журнал общей химии, - (год публикации - 2023)

5. Гржегоржевский К.В., Деникаев А.Д., Ионин С.А., Боровых Д.В., Прокофьева А.В., Тонкушина М.О., П.А. Абрамов, П.С. Постников, Н.С. Солдатова НАНОКЛАСТЕРНЫЕ ПОЛИОКСОМЕТАЛЛАТЫ: СИНТОНЫ И СКАФФОЛДЫ ДЛЯ ЗАДАЧ МОЛЕКУЛЯРНОГО РАСПОЗНАВАНИЯ Х Международный симпозиум “Дизайн и синтез супрамолекулярных архитектур”, Х Международный симпозиум “Дизайн и синтез супрамолекулярных архитектур” (год публикации - 2024)

6. К.В. Гржегоржевский, А.Д. Деникаев, С.А. Ионин, П.А. Абрамов, П.С. Постников, Н.С. Солдатова ТЕМПЛАТНЫЙ ЭФФЕКТ НАНОКЛАСТЕРНЫХ ПОМ ДЛЯ СУПРАМОЛЕКУЛЯРНОГО ДИЗАЙНА МАТЕРИАЛОВ: МОДИФИКАЦИЯ ПОВЕРХНОСТИ И ХАОТРОПНЫЕ СВОЙСТВА СОВРЕМЕННЫЕ СИНТЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДОЛОГИИ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ МАТЕРИАЛОВ (MOSM 2023, Сборник тезисов VII Международной конференции / отв. за вып. А. С. Макаров, М. Г. Учускин ; Пермский государственный национальный исследовательский университет. – Пермь, 2023. – 346 (год публикации - 2023)