КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 23-44-10021

НазваниеКонформационная динамика в образовании и функционировании биомакромолекулярных комплексов для биомедицинских и фармацевтических разработок

РуководительБочаров Эдуард Валерьевич, Кандидат химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

2023 г. - 2025 г.

Конкурс№73 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований международными научными коллективами» (БРФФИ).

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые словаИнтегративная структурная биология, спектроскопия ЯМР, малоугловое рентгеновское рассеяние, рентгеноструктурный анализ, атомно-силовая микроскопия, молекулярное моделирование, молекулярная динамика, биомакромолекулярные комплексы, конформационная динамика, нуклеоид-ассоциированные белки, цитохром P450, стеблевой комплекс рибосомы, аллостерическая регуляция

Код ГРНТИ34.15.15

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Функционирование белков, как основных структурных и функциональных единиц клетки, неразрывно связано с формированием и распадом макромолекулярных комплексов, которое является ответом на изменение внешней или внутренней (мутации) среды и ассоциировано с изменением конформации молекул. Поэтому для изучения макромолекулярных взаимодействий в белоксодержащих комплексах требуются не только знание статической структуры белка, но и данные о конформационной динамике. Наиболее сложной задачей является изучение структуры и динамики белков, которые содержат мало-структурированные подвижные участки, которые принято называть внутренне-неупорядоченными (IDP – intrinsic disordered protein). Такие участки облегчают конформационные перестройки белков, связанные изменением условий или взаимодействием с другими макромолекулами, и их количество увеличивается в ряду бактерии – археи – эукариоты. Проект направлен на изучение фундаментальных основ образования и стабильности макромолекулярных комплексов - изменения конформационной динамики полипептидной цепи белков при образовании комплексов разной природы: белок-белок/пептид, белок-ДНК, белок-РНК и белок-мембрана. Для достижения данной цели будет использован интегративный подход, основанный в первую очередь на комплементарных методах структурной биологии: ЯМР-спектроскопии, рентгеновских методах и микроскопии, а также тандемной масс-спектрометрии. Полученные экспериментальные данные будут интегрированы с вычислительными методами молекулярного моделирования и динамики (МД), включая классическую и ускоренную МД, для получения структурно-динамических моделей комплексов. В качестве конкретных объектов исследования будут выбраны биомолекулярные комплексы разной природы, играющие ключевые роли в функционировании бактериальных или эукариотических клеток и обладающие хорошо известным или предполагамым фармакологическим потенциалом. Будут исследованы взаимодействия архитектурных (нуклеоид-ассоциированных, НАБ) белков бактерий с модельной и нативной ДНК (ДНК-белок) и стеблевого комплекса рибосомы P1/P2 с белковым ингибитором трансляции (тройной РНК-белковый комплекс), а также взаимодействия в цитохром-содержащих электронпереносящих комплексах, включая комплекс мембран-связанных компонентов цитохром P450-зависимой системы человека (многокомпонентные белок-мембранные комплексы). Следует отметить, что понимание как НАБ, в первую очередь их наиболее распространённые представители – гистоноподобные белки регулируют архитектуру и функционирование бактериального генома важно для развития методов антибактериальной терапии, направленной против возбудителей социально-значимых инфекций, в том числе туберкулеза. Изучение «Стеблевого» комплекса рибосомы P1/P2 необходимо как для понимания фундаментальных основ процесса трансляции в клетках, так и для разработки противомикробных и противоопухолевых препаратов нового поколения. Информация о ключевых детерминантах межмолекулярного взаимодействия в системе цитохрома P450, поможет прогнозировать побочные эффекты, вызываемые вновь создаваемыми лекарственными препаратами и предсказать пути модуляции активности данной системы. Для модуляции структурно-динамических характеристик белковых комплексов, будет исследовано влияние биологически-активных пептидов как растительного происхождения, так и синтезированных de novo, на вышеперечисленные комплексы. На базе полученных результатов будет разработана эффективная методологическая платформа, позволяющая выбрать оптимальную комбинацию экспериментальных и вычислительных методов исследования на основе характеристик изучаемой биомакромолекулярной системы. В состав платформы войдут новые алгоритмы, улучшающие качество предсказания и валидации структуры и динамики молекулярных моделей различных белковых комплексов. Применение данной платформы позволит получать структурно-динамические модели биомакромолекулярных комплексов, востребованные в наукоемких биотехнологических разработках в фармацевтике и биомедицине.

Ожидаемые результаты
Выполнение задач проекта позволит получить новую информацию о структурах и динамике биомолекулярных комплексов разной природы (ДНК-белок, РНК-белок, мембрана-белок, белок-белок/пептид), играющих ключевые роли в функционировании бактериальных или эукариотических клеток и обладающих хорошо известным или предполагамым фармакологическим потенциалом, включая комплексы архитектурных белков бактерий с нативной ДНК и стеблевой комплекса рибосомы P1/P2 с белковым ингибитором трансляции, а также цитохром-содержащие электрон-переносящие комплексы, включая комплекс мембран-связанных компонентов цитохром P450-зависимой системы человека. Параллельно будет исследовано влияние биологически-активных молекул, включая пептиды растительного происхождения и синтезированные de novo, на вышеперечисленные комплексы. Полученные результаты расширят наши знания о сети макромолекулярных взаимодействий, которая позволяет клеткам быстро реагировать на изменения в окружающей и внутренней среде, также помогут научиться управлять этой сетью с помощью таргетных ингибиторов разной природы. Не менее важным как в фундаментальном, так и в практическом плане будет основной методологический результат проекта – создание эффективной методологической платформы, позволяющей выбрать оптимальную комбинацию экспериментальных и вычислительных методов исследования на основе характеристик изучаемой биомакромолекулярной системы. В состав платформы войдут новые алгоритмы, улучшающие качество предсказания и валидации структуры и динамики молекулярных моделей различных белковых комплексов. Применение данной платформы позволит получать структурно-динамические модели биомакромолекулярных комплексов, востребованные в наукоемких биотехнологических разработках в фармацевтике и биомедицине. В заключение следует отметить, что благодаря используемому интегративному подходу результаты будут соответствовать мировому уровню или превышать его, а возможность их практического использования определяется тем, что фундаментальное понимания механизмов, лежащих в основе комплексообразования биомакромолекулярных систем, позволит эффективно решать важные задачи в фармацевтических и биомедицинских разработках. Например, оно даёт возможность точно предсказать сайт связывания, для выбранной биологической молекулярной мишени, при создании таргетных препаратов терапии заболеваний человека, что сокращает затраты на колоссальную работу по экспериментальному скринингу подходящих веществ, и таким образом является важным фактором, который будет способствовать ускоренному развитию фармацевтических и биомедицинских технологий РФ в условиях недоступности импортных разработок и методологий.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Проект направлен на изучение фундаментальных основ образования и стабильности макромолекулярных комплексов - изменения конформационной динамики полипептидной цепи белков при образовании комплексов разной природы: белок-белок/пептид, белок-ДНК, белок-РНК и белок-мембрана. Для достижения поставленных задач использовался интегративный подход, основанный на комплементарных методах структурной биологии. В 2023 г. были разработаны необходимые методики и наработаны рекомбинантные белки, включая пробные образцы изотопно-меченных белковых препаратов. Для изучения белок-РНК-овых, белок-ДНК-овых, белок-белковых, и белок-мембранных комплексов, были выбраны рибосом-инактивирующий белок - трихобакин, ДНК-связывающие гистоноподобные белки бактерий, а также растворимые цитохромы бактерий, являющиеся компонентами электрон-переносящих комплексов, мембрансвязанные рецепторы и цитохромы млекопитающих, которые являются модельными системами при тестировании метаболизма in vitro лекарственных препаратов низкомолекулярной природы. Для полученных белковых препаратов был проведён анализ структурной гомогенности и стабильности с использованием электрофоретических, спектральных, хроматографических, и физико-химических методов, включая ЯМР, спектроскопию кругового дихроизма и динамическое светорассеяние. Эти же методы были использованы для первичного анализа и подтверждения межмолекулярных взаимодействий. Для изучения белок-пептидных взаимодействий был получен пул физиологически-активных мультифункциональных пептидов из растительных источников, принадлежащие к структурному семейству тионинов (нигеллотионинов), выделенные из семян дикорастущего растения нигелла посевная (Nigella sativa). Следует отметить, что для обобщения знания об антимикробных пептидах (АМП) был сделан обзор, опубликованный в журнале Q1 Biochimie, в котором были обсуждены как потенциальное применение АМП в качестве терапевтических средств, так и проблемы, связанные с их ограничениями, включая склонность к деградации, потенциальное возникновение устойчивости к АМП, стоимость и т.д. Также были обсуждены текущие FDA-одобренные препараты на основе АМП и стратегии обхода природных ограничений АМП. Предварительные структурно-динамические исследования комплексов и их отдельных компонентов проводили методами гетероядерной ЯМР-спектроскопии высокого разрешения, методами малоуглового рассеяния рентгеновских лучей и атомно-силовой микроскопии. Полученные предварительные данные о конформационной динамике белков и комплексов, а также структурные данные низкого разрешения анализировали совместно с молекулярными моделями, полученными путём моделирования по гомологии, молекулярного докинга и молекулярной динамики. Значительный вклад в создание экспериментально-методологической базы выполнения проекта внесла разработка новых методик сочетания гетероядерной ЯМР-спектроскопии с компьютерным моделированием, которые будут использованы в рамках проекта для изучения динамических комплексов белков. В процессе разработки данных методик был использован структурно-динамический анализ различных белок-белковых и белок-мембранных комплексов. Методом «конформационного фильтра», комбинирующий релаксационные данные ЯМР о подвижности основной и боковых цепей белков с молекулярной динамикой (МД) для идентификации конформационных ансамблей, показано превалирование «закрытого» конформационного ансамбля для димера протеазы NS2B/NS3pro вируса Денге в растворе. В то время как ошибочное использование «открытой» конформации, индуцированной неспецифическими контактами в кристалле, в течение десятилетия служило препятствием для разработки лекарственных средств от лихорадки Денге. Далее, свойство Ханкеля экспоненциального ЯМР-сигнала было использовано в новой методике достижения широкополосной гомоядерной развязки от констант спин-спинового взаимодействия, которая не только эффективно повышает разрешение, но также сохраняет чувствительность и подавляет спектральные артефакты в ЯМР-спектрах подвижных белковых комплексов. С помощью новой методики ЯМР-спектроскопии в сочетании с МД-релаксацией структуры белка в явно заданных липидных бислоях, показано, что мембранные сегменты рецепторных тирозинкиназ семейства инсулиновых рецепторов имеют подвижный функционально-важный «Pro-шарнир» в центре липидного бислоя, и таким образом, в наблюдаемом многообразии структурно-динамической организации и механизмов активации инсулиновых рецепторов следует учитывать гетерогенное и высокодинамичное мембранное окружение. Новые методики и результаты их апробации опубликованы в журналах Q1 Communications Biologу, Chemical Communications и IJMS. В заключении следует отметить, что все работы, запланированные на 2023 год, были выполнены, а результаты 2023 года, имеющие высокую собственную научную значимость, позволили создать экспериментально-методологическую базу, обеспечивающую успешное выполнение проекта в целом.

Публикации

1. Агбак Т., Лесовой Д., Хан Х., Ломзов А., Сан Р., Сандалова Т., Орехов В.Ю., Ачур А., Агбак П. Combined NMR and molecular dynamics conformational filter identifies unambiguously dynamic ensembles of Dengue protease NS2B/NS3pro Communications biology, том 6, выпуск 1, стр.1193 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1038/s42003-023-05584-6

2. Бершацкий Я.В., Кузнецов А.С., Идиатулина А.Р., Бочарова О.В., Долотова С.М., Гавриленкова А.А., Серова О.В., Деев И.Е., Ракитина Т.В., Зангиева О.Т., Павлов К.В., Батищев О.В., Бритиков В.В., Усанов С.А., Арсеньев А.С., Ефремов Р.Г., Бочаров Э.В. Diversity of Structural, Dynamic, and Environmental Effects Explain a Distinctive Functional Role of Transmembrane Domains in the Insulin Receptor Subfamily International Journal of Molecular Sciences, Issue 4, Volume 24, 2023 Feb 15, p.3906 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/ijms24043906

3. Петухов М.В., Ракитина Т.В., Агапова Ю.К., Петренко Д.Е., Конарев П.В., Бритиков В.В., Бритикова Е.В., Бочаров Э.В., Штыкова Э.В. Сравнительное структурное исследование гистоноподобных белков HU методом малоуглового рентгеновского рассеяния Кристаллография, том 68, № 6, с. 914–921 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.31857/S0023476123600143

4. Цю Т., Джахангири А., Хань Х., Лесовой Д., Агбак Т., Агбак П., Ачур А., Цюй Х., Орехов В. Resolution enhancement of NMR by decoupling with the low-rank Hankel model Chemical Communications, том 59, выпуск 36, стр. 5475-5478 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1039/D2CC06682C

5. Савицкая А., Массо-Сильва Дж., Хаддауи И., Энани С. Exploring the arsenal of antimicrobial peptides: Mechanisms, diversity, and applications Biochimie, том 214, выпуск B, стр. 216-227 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1016/j.biochi.2023.07.016

6. Бершацкий Я.В., Надеждин К.Д., Бочарова О.Б., Арсеньев А.С., Бочаров Э.В. Dimerization of transmembrane domains of receptors of the insulin receptor subfamily. Biophysical Reviews, v. 15, pages 1425–1861, S1.32. (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1007/s12551-023-01150-w

7. Рогожин Е.А. Подходы к выделению антимикробных пептидов микробного и растительного происхождения Материалы XIII Международной научной конференции «Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты», С. 220-221. (год публикации - 2023)

8. Рогожин Е.А., Иванов И.А., Дубинный М.А. Гидроксипролин-содержание антимикробные пептиды растений: химический синтез и биологическая активность Материалы Всероссийской научной конференции «Марковниковские чтения: Органическая химия от Марковникова до наших дней» (WSOC 2023), С. 88. (год публикации - 2023)