Аннотация результатов, полученных в 2023 году
На первом этапе выполнения проекта производили выведение чистых гомозиготных линий монотрансгенных животных для дальнейшего формирования политрансгенных популяций. Генотипирование линий Tg(HSP70[in]), Tg (HSP70[ex], Tg(S-FUS[1-359] проводили с использованием методики ПЦР в реальном времени. Для генотипирования Tg(APP/PS1) использовали ПЦР с анализом результатов по конечной точке. Исследуемым трансгенам не проводили секвенирование, и участок встраивания точно не определён, поэтому для дискриминации геми- и гомозигот использовали метод ∆Ct, чтобы оценить копии гена при помощи циклов достижения порогового значения. За основу для формирования монотрансгенных популяций были взяты мыши дикого типа (WT) C57Bl/6. Линия Tg(S-FUS[1-359]) поступила в виварий на основе линии IRS (CD1), которая характеризуется более высокой выживаемостью по сравнению с C57Bl/6, что важно для поддерживания популяции соответствующего трансгена. Для получения достоверных результатов мыши Tg(S-FUS[1-359]) на линии CD1 были перенесены на линию C57Bl/6 путем скрещивания Tg(S-FUS[1-359]) на линии IRS (CD1) c мышами дикого типа C57BL/6 в нескольких поколениях. Для снижения смертности новорожденных мышат использовались матери-кормилицы дикого типа линии IRS (CD1) с положительными лактационными характеристиками. В результате была выведена популяция жизнеспособных и свободно скрещивающихся мышей Tg(S-FUS[1-359]) на линии C57Bl/6. После получения популяций C57Bl/6-Tg(HSP70[in]), C57Bl/6-Tg(HSP70[ex]), C57Bl/6-Tg(APP/PS1) и C57Bl/6-Tg(S-FUS[1-359]) их подвергли инбридингу для достижения гомозиготности. Для получения мышей, несущих один аллель HSP70 и другой с геном, приводящим к развитию нейродегенеративного заболевания, использовали ранее полученных гомозиготных особей C57Bl/6((Tg(HSP70[in])/(Tg(HSP70[in])), C57Bl/6((Tg(HSP70[ex])/(Tg(HSP70[ex])), C57Bl/6((Tg(APP/PS1)/(Tg(APP/PS1)) и гемизиготных особей C57Bl/6((Tg(S-FUS[1-359]))/WT)). Вначале скрещивали гомозигот C57Bl/6(Tg(HSP70[in])/(Tg(HSP70[in]) и C57Bl/6((Tg(APP/PS1)/(Tg(APP/PS1)), в 100 % случаев поколение имело генотип C57Bl/6((Tg(HSP70[in])/(Tg(APP/PS1)). Параллельно скрещивались C57Bl/6((Tg(HSP70[ex])/(Tg(HSP70[ex])) и C57Bl/6((Tg(APP/PS1)/(Tg(APP/PS1)), что привело также в 100 % к генотипу C57Bl/6((Tg(HSP70[in])/(Tg(APP/PS1)) у потомства. Аналогичное скрещивание трансгенов HSP70 выполнено с гемизиготами C57Bl/6((Tg(S-FUS[1-359])/WT). В итоге дигемизиготное C57Bl/6((Tg(HSP70[ex])/(Tg(S-FUS[1-359])) и C57Bl/6((Tg(HSP70[in])/(Tg(S-FUS[1-359])) потомство получилось в расщеплении 1:1: моногемизиготные C57Bl/6((Tg(HSP70[ex])/(WT)) и C57Bl/6((Tg(HSP70[in])/(WT)). В результате появилось потомство, которое подвергали отбору на основе генотипирования дитрансгенных мышат в возрасте 4 недель. По итогу были отобраны следующие целевые генотипы: C57Bl/6((Tg(HSP70[in])/(Tg(S-FUS[1-359])), C57Bl/6((Tg(HSP70[ex])/(Tg(S-FUS[1-359])), C57Bl/6((Tg(HSP70[in])/(Tg(APP/PS1)), C57Bl/6((Tg(HSP70[ex])/(Tg(APP/PS1)). На мышах полученных Hsp70-трансгенных линий выполняли поведенческие и фенотипические тесты для сравнения их физиологических параметров с аналогичными у мышей исходных линий дикого типа. Все исследования выполняли первично на точке 1 и 2 месяца с момента рождения животных. Выполняли тесты: “Открытое поле” (10 минут, 30 лк). “Лабиринт Барнса” (10 минут, 300 лк). “Распознавание образов” (10 минут, 50 лк). “О-образный лабиринт” (10 минут, 20 лк в темном рукаве, 110 лк в светлом рукаве). “Резидент-интрудер” (10 минут, 50 лк, мышь-партнер белого цвета линии CD1). “Перевернутый экран” (10 минут). “Ротарод” (10 минут, 3 попытки). Грип-тест, 3 попытки. На основе полученных результатов сделан вывод об отсутствии фоновых искажений у Hsp70-трансгенных животных в области поведенческой активности по сравнению с особями дикого типа сходного возраста. Результаты демонстрируют отсутствие межгрупповых различий физиологических показателей. Для оценки фонового действия Hsp70 проведена экспериментальная работа на мышах дикого типа при однократном подкожном введении Hsp70 в высоких (5000 мкг/кг) и низких (500 мкг/кг) дозах. Исследование выполнено на 30 самцах мышей аутбредной линии CD1. На 3-й день после инъекции все мыши проходили физиологический тест: «открытое поле». Регистрировали показатели поведенческой активности: скорость перемещения, пройденный путь и количество дефекаций. На 5-й день после инъекции осуществляли забор головного мозга, тимуса, селезенки и печени. Выполняли оценку поведенческой активности животных экспериментальных колоний при введении экзогенного Hsp70. Анализ двигательной активности показал, что в группе контроля грызуны двигались со средней скоростью 8,9 ± 1,0 см/с, в группе Hsp70 500 мкг/кг – 8,4 ± 0,6 см/с, а в группе Hsp70 5000 мкг/кг – 8,4 ± 0,7 см/с. Результаты для пройденного пути: мыши группы контроля в среднем перемещались на 2671,7 ± 292,1 см, группы Hsp70 500 мкг/кг – 2507,8 ± 167,0 см, группы Hsp70 5000 мкг/кг – 2524,7 ± 222,7 см. У мышей группы контроля отмечено в среднем 1,7 ± 0,5 дефекации, в группе Hsp70 500 мкг/кг – 2,5 ± 0,5 и в группе Hsp70 5000 мкг/кг – 2,2 ± 0,7 дефекации. По всем изученным параметрам статистически значимых различий между группами в тесте «открытое поле» не выявлено. При гистологическом исследовании головного мозга у мышей всех групп были выявлены сохранная цито- и миелоархитектоника, нейроны и глия были распределены равномерно согласно слоям. При оценке иммуноморфологических эффектов Hsp70 на срезах тимуса у животных всех трех групп структура как коркового, так и мозгового вещества хорошо визуализируется, признаки структурных изменений отсутствуют, визуальных различий между группами не выявлено. Для мышей с генотипами Tg(HSP70[ex]), Tg(HSP70[in]) проводили посмертные тесты клеточного и молекулярного состава с помощью методик иммуногистохимического исследования (ИГХ) и вестерн блоттинга. ИГХ реакции проводили согласно стандартным протоколам изготовителя. Обнаружено, что экспрессия этих белков в моторной коре минимальна в данной возрастной группе или не дает полезной информации, поэтому впоследствии их использование в контексте данной работы было принято считать не репрезентативным. Для оценки экспрессии специфических иммунологических белков, наличие которых с точки зрения ИГХ определить невозможно, использовали метод белкового иммуноблоттинга. Осуществляли забор и предварительную подготовку образцов для выполнения тестов. Определяли репрезентативность внутренних контрольных групп Tg(HSP70[ex]), Tg(HSP70[in]) с мышами дикого типа по аналогии с тем, что производилась для ИГХ-анализа. Производили забор головного мозга с целью изучения возможных изменений в области первичной моторной коры больших полушарий (М1 на уровне сагиттального среза в 0,97 мм от брегмы) мышей Tg(HSP70[ex]), Tg(HSP70[in]) и дикого аллеля C57Bl/6. Впоследствии также забирали материал сиблингов C57Bl/6((Tg(HSP70[ex])/(WT)) и C57Bl/6((Tg(HSP70[in])/(WT)) для оценки влияния на экспрессию в монозиготном состоянии, в котором аллель Tg(HSP70[ex]) будет находиться в гемизиготном состоянии, а также для возможного проявления эффектов взаимодействия генов, по типу гетерозиса. У мышей линий C57Bl/6((Tg(APP/PS1)/(Tg(APP/PS1)) и C57Bl/6((Tg(S-FUS[1-359]))/WT)) также забирали материал из соответствующей зоны. Изъятый мозг препарировали на платформе с хладогентом. Выбирали соответствующие целевым зонам кусочки весом по 5 мг и помещали в пробирки типа Эппендорф для последующей заморозки жидким азотом и хранения при -80°C. После набора материала производили гомогенизацию на Мульти-вортексе с использованием лизирующего раствора и шариков для измельчения. Полученный гомогенизат центрифугировали на микроцентрифуге (7 минут, 15 тыс. об./мин). Супернатант забирали и денатурировали при температуре 100°C в течение 5 минут, после этого остужали и хранили при -20°C до проведения реакций с антителами, запланированных на 2024 г.