КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 23-24-10041

НазваниеАнализ цитотоксичности наночастиц золота и антитоксичных свойств фумарата в опытах in vivo для нужд фармкластера Калужской области

РуководительУскалова Дарья Вадимовна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Национальный исследовательский ядерный университет «МИФИ», Калужская обл

Период выполнения при поддержке РНФ

2023 г. - 2024 г.

Конкурс№76 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами» (региональный конкурс).

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-211 - Радиобиология

Ключевые словабеспозвоночные животные, протоны, цитотоксичность, наночастицы, фумарат

Код ГРНТИ76.29.62

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Проект направлен на решение задач биобезопасности использования наночастиц золота при радиотерапии злокачественных опухолей протонами. В проекте предполагается анализ цитотоксического действия наночастиц золота, используемых в качестве носителей радиоизотопов и/или лекарственных препаратов, в том числе радиофармпрепаратов, при радиотерапии протонами в терапевтических дозах, а также антитоксических свойств фумарата в опытах in vivo на модельных беспозвоночных животных. Впервые будет проведено исследование усиления токсичности наночастиц при облучении модельных беспозвоночных животных в опытах in vivo и анализ антитоксических свойств фумарата до облучения в качестве радиопротектора пролонгированного действия и после облучения в качестве средства ранней патогенетической терапии. Анализ будет проведен по ряду биохимических (МТТ-тест, ТБК-тест, активность ферментов антиоксидантной защиты), морфо-физиологических (выживаемость и плодовитость в 2-3 поколениях) и генетических (комета-тест) показателей. Выявленные нашей научной группой ранее немутационные трангенерационные повреждения у простейших и беспозвоночных животных после облучения гамма-квантами позволят провести полноценный анализ результатов и применить современные научные подходы, запланированных в данном проекте. Использование модели беспозвоночного животного Dahnia magna в предлагаемом исследовании имеет ряд преимуществ. Этот вид используется в экотоксикологических экспериментах и эпигенетических исследованиях из-за короткого жизненного цикла, высокой чувствительности к токсикантам и облучению, партеногенетического размножения и простоты культивирования в лаборатории. (Harrisetal., 2012; Tatarazakoand Oda, 2007, Alonzo, et.al., 2016; Gilbin, 2018; Савина и др., 2018). Кроме того эти ракообразные являются фильтраторами, то есть захватывают из водной среды мелкие частицы пищи, что облегчает задачу доставки наночастиц и фумарата в организм подопытных животных. В экотоксикологических исследованиях D. magna является одним из наиболее часто используемых модельных организмов для оценки токсичности разных лекарств, таких как антибиотики, противораковые препараты, антидепрессанты и противовоспалительные препараты (Tkaczyketal., 2021). Такая модель может быть предложена для первичного скрининга лекарственных препаратов, анализа терапевтических доз и концентрации частиц. Понимание общих закономерностей и механизмов комбинирования радиационных эффектов с наночастицами позволит управлять лучевыми реакциями организма, применять в радиофармакологии и в медицинской практике, в первую очередь, в широко развивающейся в настоящее время междисциплинарной науке – ядерной медицине. Выявленные в ходе проекта закономерности и механизмы формирования трансгенерационных эффектов будут также направлены на разработку технологий интегральной оценки радиационной безопасности Калужского региона.

Ожидаемые результаты
На модели беспозвоночного животного в опытах in vivo будет проведена оценка антитоксического действия фумарата в качестве радиопротектора пролонгированного действия при введении вещества до облучения и в качестве средства ранней патогенетической терапии, вводимого сразу или в ближайшие сутки после облучения. Фумарат 3-ГП является структурным аналогом этилметилгидроксипиридина сукцината и представляет собой соль 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина и фумаровой кислоты (Семенова Е.В., 2006). В настоящее время находится на этапе экспериментального доклинического исследования. Изучена фармакологическая активность соединения в дозах 25 и 50 мг/кг на модели аллоксанового диабета, при катехоламиновом повреждении миокарда, модели тканевой гипоксии, при остром нарушении мозгового кровообращения; на моделях острого и хронического гепатита. Установлено наличие антигипоксического, кардио-, нейро- и гепатопротекторого действия у изучаемого соединения (Инчина, оно Данилина, 2005; оно Инчина и соавт., 2005; Семенова и соавт., 2006; 2007; Костычев и соавт., 2009). Исследования на альтернативной модели короткоживущих беспозвоночных животных позволит получить новые сведения об антиоксидантных механизмах фумарата в опытах in vivo. Анализ динамики выживаемости и плодовитости в поколениях модельных животных позволит выявить механизмы трансгенерационных изменений при остром облучении родительских особей в терапевтических дозах в присутствии наночастиц золота. Анализ компонентов общей плодовитости позволит проанализировать механизмы нарушения репродуктивной способности тест-организма в поколениях в условиях повышения токсичности. Анализ эффектов на субклеточном уровне по изменению метаболизма и активности ферментов антиоксидантной защиты в клетках модельных тест-организмов позволит проанализировать механизмы ослабление цитотоксичности наночастиц золота при облучении протонами в опытах in vivoв присутствии фумарата. Поскольку известно, что помимо свободнорадикальных реакций и цитотоксического действия анализируемая в проекте схема применения наночастиц золота с облучением способна привести к генетическим изменениям (Dedehet.al., 2014), нами будет применен "Комета-тест" на D. magna. Сравнение цитотоксических эффектов применения наночастиц золота в сочетании с радиотерапией протонами, экспериментально обоснованное на примере модельного беспозвоночного животного, позволит выявить общие закономерности биологических эффектов, вызываемых радиацией и наночастицами. Полученная информация может лечь в основу понимания фундаментальных механизмов действия наночастиц и фумарата в схеме радиотерапии злокачественных опухолей и действия этих веществ на здоровые клетки и ткани, а также создания новых препаратов для защиты от облучения. Выявленные в ходе проекта закономерности и механизмы формирования трансгенерационных эффектов могут быть направлены на разработку экологических норм радиационной безопасности в результате попадания в окружающую среду наночастиц.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Применение ионизирующего излучения для терапии рака стало революционным прорывом в начале XX в. За последнее десятилетие существенно увеличилось количество установок протонной терапии и клиническое использование пучков протонов высокой энергии для лечения рака. Облучение опухолевой ткани неизбежно приводит к облучению здоровых клеток, а радиационно-индуцированная токсичность нормальных клеток оказывает большое влияние на всю тактику лечения. Препараты, использованные в этих целях, должны обладать высокой селективностью, эффективностью, низкой токсичностью и широким временным окном. Поиск новых мишеней и новых механизмов радиосенсибилизации и радиопротекции остается актуальной задачей, требующей решения для дальнейшего значимого повышения эффективности лучевой терапии. Целью проекта является оценка биобезопасности и биоэффективности сочетанного применения облучения пучками протонов и наночастиц золота (AuNPs) в качестве радиосенсибилизатора, а также анализ радиозащитного действия фумарат3-ГП на модели высшего беспозвоночного животного из подотряда ракообразные Daphnia magna в опытах in vivo. Для выполнения исследования были синтезированы наночастицы золота (AuNP) и фумарат (фумарат3-ГП). Синтез AuNP был осуществлен в лаборатории «Бионанофотоники» (ИФИБ НИЯУ МИФИ) одностадийным методом фемтосекундной лазерной абляции (Скрибицкий и др., 2022). Фумарат3-ГП был синтезирован на кафедре химии ИАТЭ НИЯУ МИФИ в соответствии с методикой (Данилина, Семенов, 2006; Семенов, Инчина, Семенова , 2006).В качестве модельного тест-организма использовали беспозвоночных животных ракообразных D.magna, культивируемых более 12 лет в оптимальных условиях лаборатории отделения биотехнологий ИАТЭ НИЯУ МИФИ в климатостате (модель Р2).Животные из р. Daphnia как обязательный тест-объект включены в схему установления предельно-допустимых концентраций (ПДК) веществ-загрязнителей и сточных вод в России (ПНД Ф Т 14.1:2:4.12-06). Острое облучение поколения (F0) проводили на протонном комплексе «Прометеус» в МРНЦ им. А.Ф.Цыба (Обнинск) сканирующим пучком протонов (энергия 150 МэВ) на простреле. Выживаемость и плодовитость D. magna в родительском поколении (F0) оценивали в 21-суточном эксперименте на ежедневной основе. В каждой контрольной и экспериментальной группе было от 10 до 60 особей. Первое поколение (F1) было получено из третьего помета соответствующей группы родительского поколения. Культивирование животных в поколении F1 проводили по той же схеме только без воздействия.Выживаемость оценивали по критерию Хи-квадрат. Плодовитость по количеству новорожденных на помет по критерию Манна-Уитни. Изменение метаболическую активность и соотношение живых и мертвых клеток (Cancer Cell Culture. 2011) анализировали МТТ-тестом,модифицированным для исследований эффектов на беспозвоночных животных( Сарапульцева и др., 2013), на планшетном иммуноферментном анализаторе StatFax 2100 (AwarenessTechnology, США, VIS-модель) по переходу бесцветного3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразола (МТТ) в фиолетово окрашенный формазан. Оценку МТТ-показателя провели по изменению оптической плотности (ОП) подготовленных образцов из экспериментальных и контрольных групп животных в обоих поколениях по критерию Манна-Уитни. В соответствие с полученными данными, выживаемость экспериментальных D. magna снижалась с 5 до 28,3% при увеличении дозы облучения протонами от 3 до 30 Гр. Эффект облучения усиливался 1,4 раз при сочетанном действии наночастиц золота (AuNP, 10 мкг/мл). Для оценки взаимодействия исследуемых факторов был проведен анализ средних значений показателей выживаемости в родительском поколении (F0) и трансгенерационные эффекты в первом поколении без воздействия (F1) по критерию Хи-квадрат. Согласно полученным данным, в контрольных выборках животных из обоих поколений значимых отличий в выживаемости не обнаружено (р = 0,345). Облучение приводило к снижению выживаемости в поколении F0 (https://nppsafety.iate.obninsk.ru/). Плодовитость оценивали по количеству новорожденных на помет в двух последовательных поколениях к 21-суточному возрасту животных. Согласно полученным данным, в контрольных выборках значимых отличий в плодовитости не обнаружено (р = 0,507). D.magna начали откладывать яйца в возрасте 9 дней независимо от поколения и реализовывали до 3-4 выводков. Плодовитость снижалась 1,8 раз при облучении протонами, эффект сохранялся в необлученном поколении. Хотя односуточные D. magna, которых брали в эксперименте, еще не отложили яйца, их первичные половые клетки поражались облучением, что ставило под угрозу выживание либо способность образовывать яйца.Как показано во многих исследованиях на позвоночных и беспозвоночных животных, развивающиеся эмбрионы более чувствительны к облучению, чем взрослые особи (Strefferetal., 2003; Sarapultseva, Dubrova, 2016). В этом отношении могут представлять интерес полученные нами результаты раздельного и сочетанного с облучением действия наночастиц золота. Согласно проведенному ANOVA анализу, использование наночастиц перед облучением нивелировало негативный эффект раздельного действия этих факторов, т.е. наночастицы снимали негативное действие облучения на плодовитость (р = 0,102). В первом поколении, полученном от облученных животных, негативный эффект облучения нивелировался как в случаи сочетанного действия с наночастицами, так и с фумаратом (р = 0,264 и 0,706 соответственно). Согласно результатам МТТ-анализа, наночастицы AuNP и фумарат не токсичны для тест-организма (р = 0,054 и 0,126 соответственно), а облучение протонами во всех исследуемых дозах вызывает оксидативный стресс в клетках D. magna (р = 1,07Е-4, 2,23Е-2 и 2,0Е-5 для 3, 10 и 30 Гр соответственно). Трансгенерационный эффект облучения обнаружен в первом поколении (F1), полученном от облученных родителей.Согласно проведенному ANOVA-анализу, наночастицы золота значимо усиливают токсический эффект облучения протонами (р = 3,2Е-5). Применение фумарата после облучения нивелирует негативный эффект (р = 0,118). В первом поколении наблюдается трансгенерационный эффект облучения. Комплексное применение наночастиц и фумарата снимает оксидативный стресс как в родительском, так и в первом поколении, полученном от облученных родителей (https://physbio-conf.mephi.ru/symp23/). Результаты, полученные в ходе реализации проекта, могут быть направлены на развитие технологий биомедицины, разрабатываемых и реализуемых на предприятиях, в медицинских и научных учреждениях кластера Калужской области по фармацевтике, биотехнологии и биомедицине. Применяемые в ходе проекта подходы анализа и выявленные закономерности формирования эффектов могут быть направлены на разработку технологий интегральной оценки радиационной безопасности природной среды Калужского региона.

Публикации

1. Савина Н.Б., Ускалова Д.В., Петросова, Д.Т., Сарапульцева Е.И. Биофизические методы исследования наноматериалов для биомедицинских и экотоксикологических целей с использованием Daphnia magna как модельного организма Биофизика, - (год публикации - 2024)

2. Жалнина А.А., Ускалова Д.В., Савина Н.Б., Якимова А.О., Сарапульцева Е.И. Анализ динамики развития окислительного стресса и изменения процессов регенерации поврежденных тканей после облучения in vivo электронами и протонами на примере Schmidtea mediterranea XVI Международная конференция "Безопасность АЭС и подготовка кадров": Тезисы докладов (г.Обнинск, 26-27 октября 2023г.) - Обнинск ИАТЭ НИЯУ МИФИ, ООО «Оптима-Пресс», XVI Международная конференция "Безопасность АЭС и подготовка кадров": Тезисы докладов (г.Обнинск, 26-27 октября 2023г.) - Обнинск ИАТЭ НИЯУ МИФИ, 2023, С. 201-203 (год публикации - 2023)

3. Кузьмичева О.В.,Петросова Д.Т, Ускалова Д.В., Савина Н.Б., Сабуров О.В., Сарапульцева Е.И., Уланова Т.В. Оценка радиопротектороного эффекта фумарата 3-гидроксипиридина в опытах in vivo XVI Международная конференция "Безопасность АЭС и подготовка кадров": Тезисы докладов (г.Обнинск, 26-27 октября 2023г.) - Обнинск ИАТЭ НИЯУ МИФИ, ООО «Оптима-Пресс», XVI Международная конференция "Безопасность АЭС и подготовка кадров": Тезисы докладов (г.Обнинск, 26-27 октября 2023г.) - Обнинск ИАТЭ НИЯУ МИФИ, 2023, С.213–215 (год публикации - 2023)

4. Петросова Д.Т., Кузьмичева О.В., Ускалова Д.В., Савина Н.Б., Сабуров С.Н., Шахов П.В., Сарапульцева Е.И. Анализ цитотоксичности наночастиц золота в опытах на Dapnia magna in vivo XVI Международная конференция "Безопасность АЭС и подготовка кадров": Тезисы докладов (г.Обнинск, 26-27 октября 2023г.) - Обнинск ИАТЭ НИЯУ МИФИ, ООО «Оптима-Пресс», XVI Международная конференция "Безопасность АЭС и подготовка кадров": Тезисы докладов (г.Обнинск, 26-27 октября 2023г.) - Обнинск ИАТЭ НИЯУ МИФИ, 2023, С.219–221 (год публикации - 2023)

5. Д.Т. Петросова, О.В. Кузьмичева, Д.В. Ускалова, Н.Б. Савина, В.О. Сабуров, П.В. Шахов, Е.И. Сарапульцева Analysis of cytotoxicity of gold nanoparticles in Daphnia magna in vivo experiments Physics, Engineering and Technologies for Biomedicine. The 8th International Symposium: book of Abstracts. National Research Nuclear University MEPhI., 2023. Москва, окт. 2023 года М.: НИЯУ МИФИ, - (год публикации - 2023)

6. Какора С.А., Уланова Т.В., Сарапульцева Е.И., Ускалова Д.В. Development of pharmacological cytotoxity of the drug 3-oxypiridine fumarate as an antitumor drug Physics, Engineering and Technologies for Biomedicine. The 8th International Symposium: book of Abstracts. National Research Nuclear University MEPhI., 2023. Москва, окт. 2023 года М.: НИЯУ МИФИ, - (год публикации - 2023)