КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 23-24-00648
НазваниеОсобенности функционирования микробного сообщества и ферментативной активности почв при воздействии глиотоксина почвенных грибов
РуководительТесля Анастасия Валерьевна, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Тюменский государственный университет", Тюменская обл
| Период выполнения при поддержке РНФ | 2023 г. - 2024 г. |
Конкурс№78 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами».
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-108 - Почвоведение
Ключевые словаБиологический контроль, агент биоконтроля, глиотоксин, почвы, микробные сообщества, таксономическое микробное разнообразие, микробная биомасса, дыхательная активность, микробный метаболический коэффициент, остаточные количества глиотоксина, адаптация микробного сообщества, ферментативная активность почвы
Код ГРНТИ68.05.00
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Сельскохозяйственное производство в современных условиях невозможно без применения пестицидов. Их использование является важным источником диффузного химического загрязнения, которое становится трудно контролировать. Поэтому мировое хозяйство заинтересовано в снижении зависимости от химических факторов производства и развитии и внедрении агробиотехнологий, а именно в создании биопестицидов, как основного средства биоконтроля. В настоящее время особого внимания заслуживают исследования возможности использования микробных метаболитов в качестве биопестицидов. Хорошо известным метаболитом, например, является глиотоксин, продуцируемый Trichoderma spp. Изучение глиотоксина только с позиций растение – патоген – агент биоконтроля и фитотоксичность не достаточно для полного понимания механизмов, используемых агентами биоконтроля для осуществления биологической борьбы с болезнями растений. Необходимо учитывать более сложные взаимодействия с микробиомом растения, его ризосферой, в прилегающем почвенном биотопе, а также с физической средой, учитывая тип почвы, температуру, рН и влажность растений и почвенной среды и др. параметры. Отсутствие сведений о действии глиотоксина на почвенные микробные сообщества, биохимические процессы и почвенные ферменты является недостающим звеном сложных взаимодействий всей системы биологического контроля, что и определило актуальность данной работы.
Цель Проекта, его новизна определяется комплексным исследованием по изучению влияния различных концентраций глиотоксина почвенных грибов, на особенности функционирования микробного сообщества и энзимную активность почв в динамике (на 1, 7, 14, 30, 60 и 90 день).
В рамках реализации проекта впервые будет а) исследована реакция почвенного микробного сообщества (доля грибного и бактериального компонентов биомассы почвы, С, N и Р микробной биомассы, таксономическое микробное разнообразие, микробное продуцирование СО2, экофизиологический статус, метаболическая активность, эффективность использования микроорганизмами углерода почвы и т.д.) и почвенных ферментов углеродного (хитиназы, β-глюкозидазы, ксилоназы, целлобиогидролазы, инвертазы), фосфатного (фосфотазы) и азотного (лейцинаминопептидазы, уреазы) циклов на внесение в почву глиотоксина; б) определена зависимость почвенной ферментативной и микробной активности от остаточных количеств глиотоксина; в) определено насколько велико и продолжительно по времени действие глиотоксина на почвенный микробоценоз и ферментный пул, время проявления максимального эффекта глиотоксина, степень и продолжительность «нарушения» микробного сообщества.
Ожидаемые результаты
1. Получена и проанализирована реакция микробного сообщества на внесение в почву различных доз глиотоксина в лабораторных условиях и в условиях открытого грунта: а) установлена доля грибного и бактериального компонентов биомассы почвы в зависимости от различных концентраций глиотоксина; б) дана количественная оценка биоразнообразия (индексы Шеннона и Чао1) почв при воздействии глиотоксина в сравнении с необработанной почвой. Выявлены устойчивые (численность не меняется) и доминирующие таксоны, а также биоразнообразие фитопатогенных и полезных микроорганизмов; в) определены изменения в микробном продуцировании СО2, С, N и Р микробной биомассы в ответ на действие различных концентраций глиотоксина; г) проведена комплексная оценка экофизиологического состояния микробного сообщества почвы, ее метаболическая активность, эффективность использования микроорганизмами углерода почвы под действием глиотоксина; д) будет определено насколько велико и продолжительно по времени действие глиотоксина на почвенный микробоценоз, а также насколько оно экологически значимо; время проявления максимального эффекта глиотоксина; степень и продолжительность «нарушения» микробного сообщества.
2. Будет проведена оценка интенсивности биохимических процессов в почве с различными концентрациями глиотоксина по ее ферментативной активности. А именно будет определена активность гидролитических почвенных ферментов углеродного (хитиназы, β-глюкозидазы, ксилоназы, целлобиогидролазы, инвертазы), фосфатного (фосфотазы) и азотного (лейцинаминопептидазы, уреазы) циклов. Комплексное определение указанных параметров даст возможность выяснить направление изменений в активности ферментного пула под действием различных концентраций глиотоксина.
3. Определены содержание остаточных количеств глиотоксина, степень его разложения в почве, зависимость активности почвенных микробных сообществ от остаточных количеств глиотоксина.
4. Получен комплекс новых приоритетных результатов о механизмах, факторах и процессах, лежащих в основе реакций микроорганизмов в ответ на применение глиотоксина, обеспечивающих упругость и сопротивляемость почвенного микробного сообщества к «стрессовым» воздействиям.
Ожидаемые результаты проекта будут полностью соответствовать мировому уровню в заданной научной и инновационной деятельности, а в ряде случаев превосходить его. Конечный результат проекта предоставит широкому кругу заинтересованных исследователей информацию об особенностях функционирования микробного сообщества и ферментативной активности почв под влиянием различных доз глиотоксина, обладающего бактерицидными и фунгицидными свойствами против фитопатогенов. В свою очередь, последнее определит перспективу практического их использования при создании оригинальных биологических средств нового поколения.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Глиотоксин – вторичный продукт обмена веществ (метаболит), антибиотик, производимый некоторыми микроскопическими грибами. Он не задействован непосредственно в процессах роста, репродукции и развития грибов, но помогает им конкурировать в природе с другими микроорганизмами. Оценивая возможность использования глиотоксина в качестве биопестицида в рамках выполняемого Проекта проведено исследование механизма действия глиотоксина на бактерии и на смешанные биопленки бактерии-грибы.
Было установлено, что предварительная инкубация клеток с антиоксидантом Тролоксом не уменьшала ингибирующую дозу глиотоксина, однако несколько повышала скорость роста бактерий по сравнению с одним глиотоксином. Обнаружили, что ингибирующая доза глиотоксина значительно увеличивалась при предварительной обработке бактерий 2-меркаптоэтанолом и восстановленным глутатионом. Это свидетельствует о потенциальной способности глиотоксина взаимодействовать с цистеин-содержащими белками, имеющими свободные тиоловые группы и денатурировать структуру таких белков. Используя биосенсор на тепловой шок E. coli MG1655 pIpbA-lux, мы показали, что бактерии, обработанные глиотоксином, испытывают стресс, характерный для денатурирующего агента. Электрофорез в SDS-ПААГ продемонстрировал агрегацию белков под действием глиотоксина.
В рамках выполнения работ по Проекту, впервые было установлено, что глиотоксин при действии на бактерии выступает хелатором ионов металлов из цитоплазмы или непосредственно из металлоферментов. Было определено, что ингибирующее действие глиотоксина на бактерии значительно снижалось при добавлении Zn2+ в питательную среду.
При изучении действия глиотоксина на смешанные биопленки S. aureus-C. Albicans установлено, что глиотоксин подавлял развитие биопленок, так же он подавлял метаболическую активность зрелых пленок. Полученные результаты были опубликованы в журнале Biochimie (Q 1)[https://doi.org/10.1016/j.biochi.2023.06.009]. Результаты обнародованы на сайте РИА НОВОСТИ https://ria.ru/20231129/nauka-1912108108.html и в социальной сети ВКОНТАКТЕ https://vk.com/lar_xbio.
Кроме того, впервые были получены сведения о действии глиотоксина на почвенные микробные сообщества, их функционирование и почвенные ферменты при проведении 90-дневного лабораторного эксперимента:
установлено, что в течении первых суток большая часть внесенного глиотоксина необратимо связывается (и/или метаболизируется) с почвенным субстратом. На 14 сутки глиотоксин уже не детектировался;
глиотоксин в почве оказывает мощное структурирующее действие на микробиом, снижая биоразнообразие бактерий и грибов (Linnemannia, Fusarium, Curvularia), прослеживается зависимость между количеством доминирующих родов и концентрацией внесенного в почву глиотоксина;
установлено, что глиотоксин в исследуемых концентрациях увеличивает респираторную микробную активность. Наибольший эффект отмечен в образцах с концентрацией глиотоксина 500 мкМ, 100 икМ и 50 мкМ. Увеличение скорости дыхания отмечается уже через 24 часа после внесения вещества; дозозависимый эффект отмечается и по отношению к микробной биомассе. Чем выше концентрация глиотоксина, тем меньше содержание микробной биомассы. Спустя 90 дней эксперимента микробные сообщества продолжают стимулироваться действием 500 мкМ и 100 мкМ глиотоксина. В образцах с концентрацией глиотоксина 25 мкМ и 10 мкМ показатели восстанавливаются до уровня контрольных почв;
реакция почвенных ферментов в большей части зависит от свойств фермента. Установлено, что активность N-ацетилглюкозаминидазы, лейцинаминопептидазы, фосфатазы увеличивается при действии высоких доз глиотоксина, низкие концентрации глиотоксина увеличивали активность целлобиозидазы, ксилозидазы и глюкозидазы. На 24-е и 7-е сутки заметного стимулирования ферментативной активности не происходило.
Таким образом, дальнейшее изучение свойств глиотоксина позволит определить, наметить области использования (сельское хозяйство, ремедиация).
Публикации
1. Алексей С. Васильченко, Елена В. Гурина, Константин А. Дроздов, Никита А. Вершинин, Сергей В. Кравченко, Анастасия В. Васильченко Exploring the antibacterial action of gliotoxin: Does it induce oxidative stress or protein damage? Biochimie, V. 214 (4), Part B, P. 86-95 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1016/j.biochi.2023.06.009
2. - Российские ученые поняли, как грибной яд работает против бактерий РИА НОВОСТИ, - (год публикации - )
3. - ТюмГУ вошёл в топ-10 университетов по числу победителей конкурса РНФ Новости ТюмГУ, - (год публикации - )