Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В ходе работ по проекту РНФ № 23-24-00383 в 2023 году была получена исчерпывающая информация о выраженности радиопротекторных свойств хлорофиллина (водорастворимого продукта омыления зелёного пигмента растений хлорофилла), тролокса (синтетической формы витамина E, по сравнению с токоферолом, более растворимой в воде) и рибоксина (или ионзина – рибонуклеозида, содержащего гипоксантин). Под радиопротектором подразумевается исключительно такой радиозащитный препарат, действующий непосредственно в момент воздействия на организм ионизирующего излучения и способный защитить его при дозах радиации, превосходящих летальные). Для радиопротекторов характерно только профилактическое применение – перед облучением и обычно не ранее, чем за полчаса. К примеру, табельный российский радиопротектор индралин, выбранный нами в качестве эталонного радиопротектора, применяется за 10–15 минут перед облучением. Для оценки радиопротекторных свойств указанных выше препаратов мы провели эксперимент по облучению самцов мышей линии ICR (CD-1) SPF-категории рентгеновским излучением в дозах 6 Гр, 6,5 Гр и 6,75 Гр с предварительным внутрибрюшинным введением им медного хлорофиллина, рибоксина, тролокса или индралина. Ввиду нерастворимости последнего в воде, мы готовили инъекционный раствор, содержащий индралин и винную кислоту в соотношении, близком к эквимолярному. Подобным образом удавалось получить истинный раствор. Дозировки вводимого мышам хлорофиллина и индралина составляли 100 или 150 мкг/г массы тела, тролокса и рибоксина – 100 или 200 мкг/г. Кумулятивную 30-суточную выживаемость мы рассчитывали по E.L. Kaplan и P. Mayer. Кривые выживаемости были проанализированы log-rank тестом. Индралин показал наивысшую противолучевую активность. При этом при дозировке препарата 150 мкг/г его эффективность была ниже, чем при 100 мкг/г – сказалась высокая химическая токсичность препарата. Собственно, по причине высокой токсичности всех известных по-настоящему эффективных радиозащитных веществ перед человечеством встала необходимость поиска таких радиозащитных средств, которые были бы менее токсичны. Низкая токсичность рибоксина при внутрибрюшинном введении была показана ранее. Однако, ввиду отсутствия достоверных данных относительно токсичности тролокса и хлорофиллина, мы провели соответствующие эксперименты. Согласно их результатам, медный хлорофиллин при внутрибрюшинном введении мышам вызывает смертность 16% получивших его животных в дозировке 467 мкг/г массы тела, смертность 50% получивших его мышей – в дозировке 633±37,2 мкг/г массы тела, смертность 80% – в дозировке 800 мкг/г. Тролокс же для внутрибрюшинного введения является технически не токсичным веществом: дозировку тролокса выше 675 мкг/г массы тела приготовить не удалось ввиду его низкой растворимости в воде. Однако от такой дозировки тролокса не только не погибло ни одно животное, но и состояние всех мышей после введения данной дозировки тролокса было неотличимым от такового для виварного контроля. Хлорофиллин, как и индралин, во всех экспериментах статистически значимо увеличивал выживаемость облучённых мышей. Тролокс ни в одном из экспериментов не показал значимого увеличения выживаемости по сравнению с группой облучённого контроля. Рибоксин показал его только при применении в дозировке 100 мкг/г при дозе рентгеновского излучения, равной 6,75 Гр. Для хлорофиллина, тролокса, рибоксина и индралина, вводимых внутрибрюшинно перед облучением в дозировке 100 мкг/г, на основании сведений о динамики смертности в течение 30 дней после облучения, было вычислено значение фактора изменения дозы (ФИД) – отношения дозы радиации, вызывающей гибель половины облучённых животных, получивших препарат, к дозе, вызывающей гибель половины не получивших препарат животных. Данные значения соответственно равны 1,1, 1,0, 1,07 и 1,8. Таким образом, радиопротекторные свойства хлорофиллина оказались выше, чем у рибоксина – признанного радиозащитного препарата. И хотя они существенно ниже таковых для табельного радиопротектора индралина, хлорофиллин, как и рибоксин, могут оказывать защитное действие и при применении после облучения, а также – при облучении в дозах ниже летальных, когда применение индралина нельзя считать эффективным по причине высокой химической токсичности. Конкретные данные о радиозащитных свойствах хлорофиллина, рибоксина, тролокса и индралина при фракционированном облучении будут получены в 2024 году. Методом регистрации хемилюминесценции, сопровождающей обусловленную протеканием реакции Фентона перекисное окисление фосфолипида, мы показали способность хлорофиллина угнетать липидную пероксидацию. В использованной нами модельной системе липидная пероксидация запускалась за счёт атаки на липидный субстрат гидроксильных и пероксильных радикалов, аналогично она запускается и при действии на клетки радиации. Описанный результат подтверждает предположение, что радиозащитное действие препаратов на основе хлорофилла может быть обусловлено их способностью угнетать метаболизм липидных радиотоксинов и свободнорадикальные реакции. Также в 2023 году была изучена способность хлорофиллина проникать из межклеточной среды внутрь клеток. На основании того, что спектрофотометрическая оценка показала превышение концентрации хлорофиллина в лизатах лимфоцитов, предварительно инкубированных в содержащей хлорофиллин среде с последующим отделением их от неё с помощью центрифугирования, по сравнению со средой инкубации, мы сделали вывод, что он не только способен проникать через цитоплазматическую мембрану, но и что темп его поступления в клетку выше, чем темп его выхода обратно из цитоплазмы в межклеточную среду. То есть хлорофиллин проникает в клетку по механизму активного транспорта. Но при этом он не проникает через ядерную мембрану из цитоплазмы в ядро клетки. Данный вывод мы сделали на основании того, что в литературе имеются сообщения о способности хлорофиллина снижать выраженность индуцированных радиацией повреждений ДНК клеток костного мозга и сперматогониев облучённых животных. Но проведённая нами методом комета-теста оценка влияния хлорофиллина на выраженность повреждений ДНК облучённых лимфоцитов, предварительно инкубированных в среде, содержащей хлорофиллин, не выявила его генопротекторных свойств в данной системе. То есть хлорофиллин, проникающий в цитоплазму клеток из межклеточной среды и ингибирующий вызванные радиацией свободнорадикальные реакции, защищает ДНК быстроделящихся клеток, не защищая ДНК неделящихся. Данное свойство обусловлено разрушением ядерной мембраны при митозе, поэтому хлорофиллин, попав в цитоплазму материнской клетки, может оказаться в ядрах дочерних. Но его неспособность проходить через ядерную мембрану не позволяет ему проникать в ядра неделящихся клеток и защищать их генетический аппарат от свободнорадикальных реакций. По указанной причине мы посчитали нецелесообразным масштабное изучение способности исследуемых препаратов защищать ДНК облучённых животных в 2024 г. Статья, описывающая исследование способности хлорофиллина проникать внутрь клеток была удостоена призового места на конкурсе исследователей в возрасте до 30 лет в рамках VII Съезда биофизиков России (https://fmbafmbc.ru/news/events_news/sotrudnik-gnts-fmbts-im-a-i-burnazyana-leonid-romodin-zanyal-prizovoe-mesto-na-konkurse-molodykh-uch; https://www.mgupp.ru/science/news/?ELEMENT_ID=14780). Ранее в литературе отсутствовали достоверные сведения о значениях коэффициента молярной экстинкции ε для хлорофиллина, что делало невозможным проведение адекватных измерений его концентрации. Определённое нами значение ε на длине волны 404 нм равно 33700 л/моль∙см, 405 нм – 33800 л/моль∙см, 628 нм – 8640 л/моль∙см. Используя данные значения, можно определить концентрацию медного хлорофиллина в водном растворе на спектрофотометре. Результаты работ по гранту в 2023 году представлены в 7 статьях, 6 из которых по состоянию на начало декабря 2023 года были приняты к печати в ведущих научных журналах, а также апробированы в 10 устных выступлениях на научных конференциях.