КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 23-15-00443

НазваниеСенесцентность гемопоэтических стволовых клеток и лейкоцитов как механизм старения иммунной системы нечеловекообразных приматов и человека

РуководительРыбцов Станислав Александрович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования "Научно-технологический Университет "СИРИУС", Краснодарский край

Период выполнения при поддержке РНФ 2023 г. - 2025 г. 

Конкурс№80 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-108 - Иммунология

Ключевые словастарение, сенесцентность, гемопоэтическая стволовая клетка, лимфоциты, лейкоциты, иммунная система, нечеловекообразные приматы, яванский макак

Код ГРНТИ62.33.00

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Демографический ландшафт в России характеризуется прогрессирующим старением населения, что приводит к ростущей нагрузке на здравоохранение в связи c распространенностью в данной группе заболеваний, ассоциированных с возрастом (атеросклероз, онкологические заболевания, хронические инфекции и др). Недавние исследования приписывают старению клеток организма одну из ведущих ролей в патогенезе заболеваний, обусловленных возрастом. Среди всех возрастных изменений в клетках, последнее время, “клеточную сенесцентность” считают ключевым из механизмов снижения функции всех систем организма. Сенесцентные клетки определены как устойчивые к апоптозу нефункциональные клетки, находящиеся в состоянии ареста клеточного цикла, и характеризующиеся провоспалительным секреторным фенотипом, что и определяет их вклад в старение. Сенесцентности подвержены многие типы клеток. Однако, сенесцентность иммунных клеток играет особую роль в старении организма. Так, сенесцентные нефункциональные лейкоциты накапливаются с возрастом, что снижает защиту от инфекционных и онкологических заболеваний, нарушает устранение стареющих клеток других тканей, снижая уровень регенерации тканей. Таким образом, сенесцентность иммунных клеток оказывает патологическое влияние на все системы и органы. Также, значимую роль в старении иммунной системы играют возрастные изменения в пуле гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). С возрастом ГСК теряют регенеративный потенциал и накапливают мутации, что выражается в снижении обновления иммунных клеток, их миелоидной поляризации и тем самым снижением функциональности иммунной системы и защиты от инфекционных и онкологических заболеваний. Поэтому, старение ГСК активно изучается, однако, переход ГСК в сенесцентное состояние и роль сенесцентных ГСК в старении иммунной системы остается малоисследованной областью. Более того, исследования по старению ГСК и ее сенесцентности не проводились на эволюционно близких к человеку животных, например, обезьянах. Доказанное влияние сенесцентных клеток на развитие патологий, связанных с возрастом, привлекла интерес к изучению сенолитиков и сеноморфиков – препаратов, устраняющих сенесцентные клетки и устраняющих их воздействие на организм, соответственно. При этом, основные исследования данных препаратов были проведены на мышиных моделях, которые не являются надежным источником данных для трансляции в клинические исследования в связи со значительными генетическими и эволюционными различиями человека и мыши. Поэтому, данный проект направлен на изучение механизмов старения, в частности, сенесценции лейкоцитов и ГСК у нечеловекообразных приматов (яванских макак), как эволюционно и генетически близкого объекта к человеку, что важно для понимания физиологии и патофизиологии иммунной системы человека, а также для разработки методов тестирования сенолитиков и сеноморфиков в биологических исследованиях. В рамках проекта планируется современным методами выявить сенесцентные лейкоциты и ГСК яванских макак по активности SA-b-Gal, подтвердить их сенесцентный статус по другим маркерам сенесцентных клеток p16 INK4a, HMGB1, γH2AX, и в функциональных тестах. С помощью поклеточного РНК секвенирования планируется изучить транскриптом сенесцентных лейкоцитов и ГСК яванских макак для выявления сигнальных и метаболических путей, транскрипционных факторов, приведших к и поддерживающих программу сенесцентности. Также, будут выполнены in vitro тесты для изучения действия известных сенолитиков на сенесцентные лейкоциты и ГСК приматов. Новизна проекта обусловлена практически полным отсутствием данных о сенесцентности клеток иммунной системы и ГСК для яванских макак. Такие фундаментальные иммунологические исследования внесут большой вклад в понимание функционирования и старения иммунной системы, генетически и эволюционно приближенной к человеческой. Практически предлагаемое исследование направлено на разработку технологий снижения потерь от социально значимых заболеваний путем устранения сенесцентных клеток.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения проекта будут получены новые данные в актуальных областях исследований – клеточной сенесцентности, функционирования и старения клеток иммунной системы и гемопоэтических стволовых клеток [1-3]. Новизна результатов связана с выполнением проекта на нечеловекообразных приматах (яванском макаке), для которых в данных областях знаний нет систематических данных по старению гемопоэтические системы в контексте ее иерархии. Также новым является подход по изучению ex vivo функции сенесцентных лейкоцитов и ГСК, с использованием адаптированных из других областей науки функциональных тестов, которые позволят оценить клеточные механизмы возрастных изменения иммунной системы. Будет изучен транскриптом сенесцентных лейкоцитов и ГСК на уровне единичных клеток с использованием современных технологических и биоинформатических подходов для определения консервативных сигнальных путей и транскрипционных факторов, регулирующих сенесцентность и старение у человека и нечеловекобразных приматов. Значимость результатов будет определяться получением уникальной базы данных по количественному и качественному составу сенесцентных клеток в гемопоэтической иерархии приматов разных возрастов (включая очень старых животных), а также их поклеточных транскрипционных профилей, что позволит глубже понять механизмы старения, сенесцентности, иммунных реакций в пожилом возрасте, а также влияние на эти процессы сенолитиков, на эволюционно и генетически близком к человеку объекте. Это позволит с более высокой степенью надежности экстраполировать полученные знания на человека. 1. Hernandez-Segura A, Nehme J, Demaria M. Hallmarks of Cellular Senescence. Trends Cell Biol. 2018 Jun;28(6):436-453. doi: 10.1016/j.tcb.2018.02.001. Epub 2018 Feb 21. PMID: 29477613. 2. Martínez-Zamudio RI, Dewald HK, Vasilopoulos T, Gittens-Williams L, Fitzgerald-Bocarsly P, Herbig U. Senescence-associated β-galactosidase reveals the abundance of senescent CD8+ T cells in aging humans. Aging Cell. 2021 May;20(5):e13344. doi: 10.1111/acel.13344. Epub 2021 May 3. PMID: 33939265; PMCID: PMC8135084. 3. de Haan G, Lazare SS. Aging of hematopoietic stem cells. Blood. 2018 Feb 1;131(5):479-487. doi: 10.1182/blood-2017-06-746412. Epub 2017 Nov 15. PMID: 29141947.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Возрастные изменения кроветворения и иммунитета В ходе первого этапа проекта были проведены общий анализ крови и биохимические исследования плазмы, а также обнаружены количественные изменения субпопуляций иммунных клеток у человека и яванских макак разных возрастных групп. Выявлены возрастные биохимические изменения в плазме крови - повышение концентрации триглицеридов у женщин и обоего пола, увеличение соотношения глобулин/альбумин, концентрации глюкозы, общего холестерина, билирубина, лактатдегидрогеназы и ряда другие ферменты. У обоих видов выявлен половой диморфизм показателей крови. В будущем планируется расширить выборку для поиска статистически достоверных маркеров старения. Функциональные изменения иммунитета У человека с возрастом происходит накопление классических Т-регуляторных клеток CD3+CD4+CD25hiCD127loHLA-DR+, CD8Treg, CD3+CD8+HLA-DR+, CD3+CD8+HLA-DR+CD127-, а также увеличение количества активированных CD25+ и HLA-DR+ лимфоцитов обнаружено у людей и макак. Кроме того, были разработаны функциональные тесты для анализа фагоцитоза, пролиферативной и супрессорной активности стареющих иммунных клеток у людей и яванских макак. Отмечается тенденция к снижению функциональной активности этих популяций с возрастом. Эти популяции были предложены в качестве перспективных объектов изучения старения иммунной системы на следующем этапе проекта. Старение популяций иммунных клеток На втором этапе у добровольцев-доноров и яванских макак различных возрастных групп определяли активность SA-β-Gal (старение-ассоциированной бета-галактозидазы) – основного маркера клеточного старения. SA-β-Gal анализировали на моноцитах (в том числе классических и неклассических), на Т-лимфоцитах (цитотоксических, хелперных и Т-регуляторных, включая новые популяции с супрессорной активностью). Для подтверждения стареющего статуса лимфоцитов SA-β-Gal+ и SASP на небольшом количестве клеток были разработаны мультиплексные количественные методы RT-qPCR. Наличие циркулирующих стареющих клеток у людей и макак было подтверждено с помощью внутриклеточного и внутриядерного иммуноокрашивания и конфокальной микроскопии путем анализа маркеров повреждения ДНК (yH2AX и HMGB1). Таким образом, у животных старшей возрастной группы выявлены признаки повреждения ДНК и генотоксического стресса (по экспрессии yH2A.X и HMGB1). Активация лимфоцитов коррелировала с активностью SA-β-Gal. В SA-β-Gal-положительных популяциях Т-хелперных клеток и CD3+CD8+ цитотоксических лимфоцитов обнаружено 9% непролиферирующих клеток, однако признаков старения не обнаружено по экспрессии генов остановки клеточного цикла p16 и p21, но наблюдалось повышенное выражение TNF. Эти данные скорее указывают на то, что активность SA-β-Gal связана с активацией лимфоцитов и секрецией компонентов SASP, что отличается от классического механизма старения, обнаруженного в тканевых фибробластах, связанного с остановкой клеточного цикла. Также обнаружено снижение функциональной активности врожденной иммунной системы с возрастом. В старшей возрастной группе выявлено снижение активности гранулоцитов на 30%, а также снижение фагоцитоза в моноцитах с высокой активностью SA-β-Gal. Это наблюдение может быть в дальнейшем использовано для поиска и изучения возрастных изменений миелоидного компонента иммунной системы. Стратегия гейтирования была также разработана для анализа стволовых клеток крови из костного мозга яванских макак. Идентифицированы основные популяции стволовых клеток костного мозга яванских макак и разработаны подходы к функциональному анализу и определению старения в популяциях HSPC. Сравнение HSPC макака и HSPC пуповинной крови человека подтверждает фенотипическую идентичность этих популяций стволовых клеток. В результате первого года исследований была разработана методическая база для комплексного изучения возрастных изменений кроветворения и иммунной системы, которая в дальнейшем будет совершенствоваться и использоваться как инструмент и методология изучения иммунного старения. Результаты данной работы могут быть использованы в дальнейшем для выявления консервативных механизмов развития старческих патологий на примере неантропоморфных приматов. Уникальность образцов макак Cynomolgus в нашем исследовании заключается в том, что для анализа была выбрана группа очень старых макак (возраст эквивалентен человеку в возрасте 65–100 лет). Иммунное старение таких пожилых приматов не изучались ни в России, ни в мировой практике. В этом возрасте происходят наиболее радикальные изменения здоровья и лавинообразное накопление признаков старения. Кроме того, в этой возрастной группе самый высокий уровень смертности. Таким образом, изучение причин старения в этой группе предоставит эксклюзивные данные для понимания подходов к продлению здоровья и долголетия.

 

Публикации

1. Мартышкина Ю.С., Терещенко В.П., Богданова Д.А., Рыбцов С.А. Reliable Hallmarks and Biomarkers of Senescent Lymphocytes International Journal of Molecular Sciences, MDPI (Basel, Switzerland), 24, 21, 15653 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/ijms242115653

2. Лысакова Е.В., Шумеев А.Н., Лактюшкин В.С., Чувпило С.А., Рыбцов С.А. Assay Development for Phagocytosis Activity Evaluation Biol. Life Sci. Forum, MDPI in The 2nd International Electronic Conference on Microbiology, Biol. Life Sci. Forum 2023, 31 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/ECM2023-16444

3. Мартышкина Ю.С., Терещенко В.П., Рыбцов С.А. Identification and characterization of senescent cells in human and nonhuman primate peripheral blood CD3+ T-lymphocyte populations. Proceedings of the 9th International Electronic Conference on Medicinal Chemistry, 1–30 November 2023, Med. Sci. Forum 2023, 2, x (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/ECMC2023-15673

4. Матвеева К.С., Шевырев Д.В. SA-β-galactosidase activity in effector and regulatory T cells. MDPI in Proceedings of the 9th International Electronic Conference on Medicinal Chemistry, session Novel and Sustainable approaches in Medicinal Chemistry, Med. Sci. Forum 2023, 2, x, MDPI, Basel, Switzerland, (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/ECMC2023-15896

5. - Сенесцентность гемопоэтических стволовых клеток и лейкоцитов как механизм старения иммунной системы нечеловекообразных приматов и человека Официальный сайт Университета Сириус, - (год публикации - )