Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Проведен анализ и систематизация литературных данных по летучим соединениям – продуктам метаболизма патогенных микроорганизмов (E.coli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, дрожжей и плесневых грибов) на различных субстратах. Выделены несколько групп летучих соединений, связанных с ростом и размножением патогенных микроорганизмов в сыром молоке, в технологическом процессе изготовления молочных продуктов, а также естественными изменениями состава продуктов в процессе хранения неконтаминированного сырья. Полный профиль легколетучих соединений молока включает 107 соединений. По результатам проведенного анализа литературы выбраны целевые летучие аналиты. Разработан алгоритм выбора сорбентов для создания поликомпозитных покрытий, содержащих 2-3 модификатора сходной или различающейся по физико-химическим свойствам структуры для детектирования легколетучих соединений различных классов, в первую очередь, целевых летучих аналитов, состоящий из 5 этапов. При создании композитного покрытия из двух сорбентов рекомендуется выбор сорбентов из разных групп, максимально отличающихся друг от друга (крайние точки в разных кластерах), при создании композитного покрытия из трех сорбентов рекомендуется выбор сорбентов из разных групп, при этом допускается наличие двух сорбентов, которые могут быть из одной подгруппы. При возможности выбора сорбента из подгруппы со схожими сорбционными характеристиками следует отдавать предпочтение сорбентам с одинаковым способом нанесения покрытия. Проведена оптимизация геометрии области и способа нанесения покрытий на электроды пьезокварцевого резонатора с числом сорбентов 2-3 для создания устойчивых и стабильных сенсоров. Было исследовано три способа формирования композитных покрытий из двух и трех сорбентов: 1. на разные стороны пьезокварцевого резонатора (обозначение - 1/2) 2. последовательное нанесение сорбентов из индивидуальных растворов (сэндвич-технология) на каждую сторону резонатора (обозначение - 1/2 последовательно) 3. нанесение из смеси растворов сорбентов на каждую сторону резонатора (обозначение - 1/2 вместе). Также было изучено три способа нанесения покрытия: 1. статического испарения капли 2. погружения в суспензию сорбента 3. напыление из растворов и суспензий сорбентов В качестве критерия для оптимизации выбрана массовая чувствительность, которая при одновременном измерении на нескольких сенсорах пропорциональна максимальному отклику сенсора. Оптимизированы способ нанесения и массы сорбентов в композитных покрытиях для селективного определения паров целевых аналитов. Проведено сравнение аналитических характеристик сенсоров с поликомпозитными покрытиями с матрицей родственных сенсоров. Установлено, что для поликомпозитных покрытий наблюдается 1,5-5 кратное увеличение удельной массовой чувствительности сенсоров к парам целевых летучих аналитов. При этом замечено, что при использовании сочетаний сорбентов по предложенному алгоритму в композитных покрытиях наблюдается увеличение числа аналитов с повышенной селективностью микровзвешивания паров летучих соединений по сравнению с парами воды, что важно при анализе проб сырого молока. Установлено, что для поликомпозитных покрытий наблюдается снижение в 10 раз пределов обнаружения целевых аналитов в газовой фазе над водными растворами, и увеличение диапазона линейности отклика сенсора, следовательно, возможно расширение концентрационных границ чувствительности сенсоров, а также увеличения концентрационного диапазона для надежной идентификации летучих соединений в газовой фазе над пробами сырого молока по расчетным параметрам сорбции. Отмечено, что для повышения эксплуатационных характеристик покрытий с применением полимерных и макромолекулярных сорбентов необходимо введение в покрытие наноструктурированных сорбентов. Проведено сравнение кинетических особенностей сорбции паров целевых летучих аналитов на поликомпозитных покрытиях с матрицей сенсоров с монопокрытиями. Учитывали как точечные характеристики кинетических кривых, так полный набор откликов сенсоров. По результатам анализа хроночастограмм сенсоров с композитными и монопокрытиями предложен дополнительный расчетный параметр β, который повышает вероятность и надежность идентификации летучих компонентов в смеси. Обоснована надежность и информативность расчетных параметров сенсоров и алгоритма построения «визуальных отпечатков» сигналов сенсоров с композитными покрытиями для идентификации летучих соединений в смеси без предварительного разделения. Показано, что по форме «визуальных отпечатков» максимальных сигналов сенсоров с поликомпозитными покрытиями можно обнаружить компонент, преобладающий в равновесной газовой фазе над смесью, и установить присутствие дополнительных компонентов, без их идентификации. Для увеличения надежности идентификации веществ в смесях предложено 3 способа расчета параметров эффективности сорбции паров тест-веществ для оценки качественного состава смесей по сигналам композитных покрытий. Новые параметры были проверены при идентификации тест-веществ в модельных смесях, полученные расчетные значения параметров для модельных смесей позволили идентифицировать все компоненты и позволяют надежно идентифицировать в газовых смесях карбоновые кислоты (группой и отдельно масляную, изовалериановую кислоты), изопентанол, бутанон-2 и другие целевые аналиты. Разработан алгоритм получения информации о количественном составе модельных смесей по выходным данным от сенсоров с поликомпозитными покрытиями, который включает в себя 1) проверку на аддитивность значений площадей «визуальных отпечатков» (Sв.о.) для композитных покрытий, что позволяет прогнозировать количественные данные по результатам сорбции на индивидуальных сорбентах. Проверка осуществляется либо по 3σ-критерию, либо по уравнениям зависимости Sв.о. от массы сорбентов. 2) Оценку относительного содержания веществ (ω, %) в газовой фазе методом простой нормировки по данным для покрытия с сохранением аддитивности. При наличии значимых отклонений от аддитивности необходимо введение поправочного коэффициента на отклонение от аддитивности, который рассчитывается по экспериментальным данным градуировочных зависимостей для целевых аналитов. Составлено и апробировано четыре варианта математических моделей прогнозирования сорбционных свойств поликомпозитных покрытий с учетом природы, массы сорбента и особенностей изготовления покрытий, на основе проекционных и регрессионных методов. Ошибка прогноза для исследуемых покрытий не превышает 15 %, при замене в покрытии одного сорбента с родственными свойствами погрешность предсказания увеличивается до 25%. На основании проведенных исследований разработан общий алгоритм изготовления сенсоров с поликомпозитными свойствами для детектирования летучих аналитов в газовых смесях, который содержит несколько стадий: 1. Выбор перспективных сочетаний сорбентов по описанному алгоритму (при необходимости создания покрытия для других классов летучих веществ) 2. Прогнозирование сорбционных свойств покрытий для разных способов формирования и нанесения покрытия для выбранных летучих соединений 3. Приготовление растворов и суспензий сорбентов в оптимальных растворителях; 4. Формирование покрытия по заданным параметрам. 5. Расчет сорбционных параметров для оценки качественного состава модельных смесей, в том числе кинетических, по базе данных для сенсоров с монопокрытиями. 6. Проверка работоспособности расчетных параметров по двум целевым летучим аналитам различной природы, оценка аддитивности вклада сорбентов по целевым веществам, отклонение экспериментальных значений от рассчитанных не более, чем на 15%, является удовлетворительным. По результатам проведенных исследований 3 и 4 стадии алгоритма уточнены и конкретизированы для формирования покрытий, позволяющих надежно детектировать целевые летучие веществ в газовой фазе над водными растворами.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
1. По итогам работы для анализа газовой фазы над пробами сырого молока были выбраны следующие сенсоры: 1) 18К6+КМК 2) холин+сорбит/УНТ 3) холин+сорбит/АОК. 4) 18К6+ТХ100/УНТ. 5) 18К6+хитозан/АОК. 6) Тween+ТХ-100/УНТ. 7) ДГК+хитозан/АОК. 8) Эритрит+АОК. Масса покрытия 7-10 мкг. Минимальное количество сенсоров, необходимых для проведения анализа в условиях хозяйств составляет первые три сенсора. При этом возможно определение присутствия патогенных микроорганизмов в молоке, но для дифференциации исследуемых летучих соединений необходимо от 6 до 8 сенсоров со снижением ошибки классификации с 20 до 5 %. 2. В таблице 7 Приложения представлены статистически значимые (по t-критерию) коэффициенты корреляции между показателями (регистрируемыми и расчетными) пьезосенсоров и составом/ микробиологическими показателями сырого молока. Эти показатели учтены при расчете и составлении данных для формирования многомерных паттернов пьезонановесов и формировании матрицы данных для прогнозирования микробиологических показателей сырого молока (КМАФаНМ, содержание грибов, плесени дрожжей, оценки наличия патогенных микроорганизмов). Также представлены коэффициенты корреляции выходных данных сенсоров при различных способах обработки проб молока. Эти данные использовали для уточнения условий анализа газовой фазы молока для прогнозирования микробиологических показателей сырого молока. 3. Набор надежных многомерных паттернов (по совокупности данных от массива сенсоров), рассчитанный по выходным данным пьезонановесов с поликомпозитными покрытиями представлен в таблице 16, Приложения. Для дифференциации микрофлоры сырого молока, оценки микробиологической обсемененности сырого молока используют этот набор для сравнения. Рассчитывают параметр подобия (Shuba A.A. Chemosensors, 2021) при сравнении паттерна для измеренной пробы молока и в таблице. При значени параметра подобия более 80 % паттерн считается идентифицированным в данной пробе молока. Также представлены паттерны для некоторых изученных соединений. Будут определены наборы параметров массива сенсоров, сформированные в многомерные паттерны, позволяющие дифференцировать наличие изучаемых бактерий, дрожжей, плесневых грибов в сыром молоке по результатам детектирования набора целевых летучих аналитов в газовой фазе над пробами сырого молока. 4. Способ входного контроля микробиологических показателей сырого молока с применением пьезонановесов с поликомпозитными покрытиями. Будет прописан способ оценки микробиологических показателей (общая бактериальная обсемененность, количество дрожжей и плесневых грибов, наличие патогенных микроорганизмов) по результатам анализа газовой фазы над пробами сырого молока набором пьезосенсоров с поликомпозитными покрытиями. Для определения микробиологических показателей сырого молока посредством анализа газовой фазы над пробами молока с помощью сенсоров с поликомпозитными покрытиями возможно проведение анализа в нескольких вариантах: 1) Для проведения анализа в условиях ферм: Анализ выполняется с использованием прибора «Диагност-Био-8» с фронтальным вводом газовой фазы в ячейку детектирования. Формируется массив сенсоров с 4 покрытиями: сенсор 1 - 18К6+КМК, сенсор 2 – холин+сорбит/УНТ, сенсор 3 – холин+сорбит/АОК, сенсор 4 – 18К6+ТХ100/УНТ. Приготовление сенсоров и их тренировка по парам летучих веществ и воде производится как описано в п.1 "Ожидаемые результаты". Далее проводится анализ газовой фазы над пробой молока (V=0.05мл) в режиме 40с сорбция, 80 с десорбция. Общее время одного измерения 120 с, анализ каждой пробы проводится не менее двух раз. Перед началом измерений проб молока и в конце рабочего дня в аналогичном режиме проводится измерение пробы дистиллированной воды, как внутреннего стандарта. С помощью программы в таблицу фиксируются сигналы сенсоров на 40 с и 120 с измерения. Далее рассчитываются усредненные сигналы сенсоров для проб молока и воды, затем рассчитываются относительные сигналы сенсоров (Fотн(40) и Fотн(120)) путем деления усредненных значений сигналов сенсоров для проб молока на усредненные сигналы сенсоров в парах воды. А также рассчитывают коэффициент b (бета), предложенный ранее, который в первом приближении оценивает скорость десорбции веществ с покрытий сенсоров. Далее по градуировочным уравнениям (на рисунках 6,7 Приложение) рассчитывается значение логарифма КОЕ (КМАФАнМ) для проб молока. Рассчитывают прогнозируемые значения lg(КОЕ) в пробах молока, при этом, если прогнозируемое содержание КОЕ КМАФАнМ по сигналам сенсора 3 имеет отрицательное значение, значит, в молоке содержатся дрожжи и плесень, в этом случае усредняются значения, рассчитанные по данным 1 и 2 сенсора, при этом будет рассчитано общее содержание микроорганизмов в молоке (КМАФАнМ, дрожжи, плесень). Если прогнозируемые значения для сенсоров 1 и 2 значительно превышают градуировочный диапазон (более 10 lg(КОЕ)), эти пробы молока необходимо проанализировать в лаборатории, так как велика вероятность присутствия в этих пробах патогенных микроорганизмов (Staphyloccocus ssp, Klebsiella ssp, Enterococci ssp. и др.), общее содержание КМАФАнМ в этом случае может быть оценено по рассчитанному значению сигнала сенсора 3, при содержании дрожжей и плесени не более 1000 КОЕ/мл. Данный способ применим для сырого молока с жирностью менее 4,4% масс., и содержанием сухих веществ от 10 до 13 % масс . Погрешность определения КМАФАнМ с помощью данного способа +- 1lg(КОЕ). 2) Для проведения анализа в лабораторных условиях: Анализ выполняется на приборе «МАГ-8» с инжекционным вводом равновесной газовой фазы в ячейку детектирования. Для этого формируется массив сенсоров с поликомпозитными покрытиями: сенсор 1 – 18К6+хитозан/АОК, сенсор 2 – ДГК+хитозан/МКЦ, сенсор 3 – хитозан+КМК (или 18К6+КМК), сенсор 4 – холин+сорбит/УНТ, сенсор 5 - холин+эритрит/АОК, сенсор 6 – 18К6+ТХ-100/АОК, сенсор 7 – Tween+TX-100/УНТ, сенсор 8 – эритрит+АОК (или КМК+АОК). Далее проба молока объемом 20 см3 помещается в стерильную герметичную емкость объемом 100 см3 и выдерживается 30 мин при комнатной температуре для достижения равновесия на границе раздела «молоко-воздух». Равновесную газовую фазу объемом 3 см3 вкалывают в ячейку детектирования на 2 секунде от начала измерения, и записывают в сигналы сенсоров в течение 80с. Также перед началом анализа и по его завершению аналогичным образом измеряют равновесную газовой фазу над пробой дистиллированной воды. Проводят минимум 2 параллельных измерения пробы молока, далее пробу помещают в ультразвуковую ванну и обрабатывают в течение 3 минут ультразвуком мощностью 50 Вт. Через минуту после окончания обработки пробы молока ультразвуком проводят повторное измерение равновесной газовой фазы этой же пробы. Далее рассчитывают относительное изменение сигнала 4 сенсора Δ в относительных единицах: Δi = (Fi,после обработки УЗ – Fi,до обработки)/ Fi,до обработки. По нему далее рассчитывают КМАФАнМ по формуле: lg(КОЕ)=(Δ+0,327)/0,1513. Если прогнозируемое значение КМАФАнМ отрицательное, количество дрожжей и плесени в пробе более 10000 КОЕ/см3. Если прогнозируемое значение КОЕ больше, чем рассчитанное по сигналам сенсора 3 в прошлом пункте, вероятность присутствия патогенных микроорганизмов более 80 %, необходим более детальный анализ. Более точно оценить содержание КМАФАнМ, дрожжей и плесени можно с применением математических алгоритмов. Для этого используют полученные в ходе предыдущих измерений данные. В качестве переменных применяют информативные участки выходных кривых сенсоров при сорбции равновесной газовой фазы над пробой молока и расчетные параметры A из многомерных паттернов. Формируют массив исходных данных и с помощью многомерной регрессии, построенной методом проекции на латентные структуры, прогнозируют КМАФАнМ, содержание дрожжей и плесени в пробе молока (регрессионные коэффициенты переменных для оптимального числа главных компонент для трех моделей представлены в таблице 11, Приложения). Погрешность определения для полученных математических моделей: КМАФАнМ +-0,390 lg(КОЕ/см3), содержание дрожжей +-0,535 lg(КОЕ/см3), содержание плесени +-0,587 lg(КОЕ/см3). 5. По результатам опубликовано 4 статьи в российских и зарубежных журналах, 3 статьи в журанлах, индексируемых в скопус Scopus, 1 статья в журналы пищевого и технологического профиля, индексируемого в RSCI, подготовлена и направлена 1 статья в журнал Sensors.