КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 19-75-10030

НазваниеДоклинические испытания протокола превентивной генной терапии для повышения жизнеспособности нейронов головного мозга при угрозе ишемического инсульта и генной терапии сдерживания гибели нейронов в первые часы возникновения инсульта у мини-свиней

РуководительСафиуллов Зуфар Зуфарович, Кандидат медицинских наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Казанский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации, Республика Татарстан (Татарстан)

Период выполнения при поддержке РНФ 07.2022 - 06.2024 

Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по мероприятию «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными (41).

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-401 - Молекулярная и клеточная медицина

Ключевые словааденовирусный вектор, сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), глиальный нейротрофический фактор (GDNF), нейрональная молекула клеточной адгезии (NCAM), превентивная генная терапия, мононуклеарные клетки пуповины крови человека, лейкоконцентрат, средняя мозговая артерия, ишемический инсульт головного мозга, крыса, мини-свинья.

Код ГРНТИ34.03.37

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Естественные ограничения регенерации в ЦНС являются одной из основных проблем лечения ишемических инсультов головного мозга. Среди активно разрабатываемых подходов к сдерживанию постишемической нейродегенерации является доставка в мозг терапевтических генов, кодирующих молекулы нейропротекторного действия. На сегодняшний день не существует готовых, апробированных и эффективных препаратов, содержащих генетический материал, для терапии ишемического инсульта головного мозга. В ходе выполнения работ, поддержанных грантами РНФ, нами разработан простой, безопасный и экономичный способ получения аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного рекомбинантным генетическим материалом, для персонифицированной прецизионной генной терапии. Использование лейкоцитов периферической крови пациента в качестве клеточных носителей рекомбинантных генов человека для временной продукции терапевтических молекул с целью коррекции патологического процесса в ЦНС может быть одним из прорывных направлений в генной терапии. Важно отметить, что трансдукцию лейкоконцентрата проводят с помощью химерных аденовирусных векторов (Ad5/35F), способных эффективно трансдуцировать все ядросодержащие клетки через мембранный рецептор CD46, в контейнере для крови, что исключает технологию культивирования клеток in vitro с использованием препаратов животного происхождения, антибиотиков и рекомбинантных факторов роста. Впервые в ходе испытания аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генами сосудистого эндотелиального фактора роста, глиального нейротрофического фактора и нейрональной молекулы клеточной адгезии, для терапии ишемического инсульта в острой фазе и для превентивной генной терапии при угрозе инсульта головного мозга в моделях на мини-свиньях нами было установлено позитивное влияние генно-клеточного препарата на морфо-функциональное восстановление головного мозга подопытных животных. Для успешной трансляции аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного рекомбинантным генетическим материалом, в клиническую практику требуется проведение доклинических исследований биобезопасности генно-клеточного препарата. В настоящем исследовании впервые в экспериментах in vitro будет разработан протокол эффективной и безопасной трансдукции лейкоцитов с помощью аденовирусного вектора Ad5/35F в контейнере для крови и изучено влияние вектора на фенотипический, секретомный и геномный профиль клеток в составе лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом. В экспериментах in vivo биобезопасность внутривенной инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного рекомбинантным генетическим материалом, планируется изучить на крупных животных, анатомические, физиологические и биохимические характеристики которых приближены к человеку. После внутривенной инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного рекомбинантным генетическим материалом, мини-свиньям с инсультом головного мозга будут изучены миграция генетически модифицированных лейкоцитов в организме подопытных животных и их влияние на уровень цитокинов, хемокинов и факторов роста в крови и на патоморфологические изменения в периинфарктной области головного мозга. Способ доставки терапевтических генов, временно продуцирующих нейротрофические факторы, с помощью аутологичного лейкоконцентрат для генной терапии ишемического инсульта является оригинальным и ни в одном из медицинских центров мира экспериментально не проверяется. Полученные данные могут служить основой для разработки нового класса лекарственных средств на основе препаратов крови, содержащих генетический материал, для лечения ряда социально-значимых заболеваний человека, к которым относится ишемический инсульт.

Ожидаемые результаты
Ожидаемые результаты заявленного проекта будут иметь важное научное фундаментальное и прикладное медицинское значение. Наработанные в препаративных количествах химерные аденовирусные вектора, несущие по отдельности гены человека vegf165, gdnf и ncam1 и ген репортерного зеленого флуоресцирующего белка (gfp), будут использованы для получения аутологичного обогащенного рекомбинантным генетическим материалом лейкоконцентрата. Впервые будут получены сведения о миграции генетически модифицированных GFP-позитивных лейкоцитов в головной мозг и органы иммунной защиты мини-свиней с инсультом после внутривенной инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного геном репортерного зеленого флуоресцирующего белка (gfp). Тот факт, что генетически модифицированные GFP-позитивные лейкоциты будут обнаружены в периинфарктной области, как при введении обогащенного рекомбинантным генетическим материалом лейкоконцентрата через 4 часа после моделирования ишемического инсульта (генная терапия в острую фазу), или за 2 суток до операции (превентивная генная терапия), может служить доказательством влияния генетически модифицированных лейкоцитов на сдерживание гибели нейронов при инсульте и последующем положительном ремоделировании периинфарктной области мозга. Также будут получены сведения о влиянии генетически модифицированных лейкоцитов в местах их локализации на морфологические характеристики окружающих тканей. Патоморфологический анализ периинфарктной области через 3 недели после моделирования инсульта позволит установить влияние генетически модифицированных лейкоцитов на постишемическое восстановление нервной ткани в периинфарктной области мозга. Ожидается, что результаты мультиплексного анализа цитокинов, хемокинов и факторов роста в крови мини-свиней с ишемическим инсультом головного мозга через 1, 2 и 3 недели после инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного рекомбинантными генами человека vegf165, gdnf и ncam1, позволят сделать заключение о возможном иммуногенном, аллергезирующем и пирогенном влиянии генетически модифицированных лейкоцитов на организм подопытных животных. По результатам настоящего исследования будет разработан протокол эффективной и безопасной трансдукции лейкоконцентрата, полученного из 50 мл периферической крови мини-свиньи, химерным аденовирусным вектором (Ad5/35F-GFP), в контейнере для крови. В ходе выполнения заявленных работ будет установлен клеточный состав нативного и генетически модифицированного лейкоконцентрата. Впервые будут получены данные о влиянии химерного аденовирусного вектора Ad5/35F-GFP на фенотипические характеристики лейкоцитов в составе обогащенного рекомбинантным генетическим материалом лейкоконцентрата, а также на характер экспрессии GFP-позитивными лейкоцитами цитокинов, хемокинов и факторов роста и на транскриптом GFP-позитивных лейкоцитов. Также будут получены новые данные о влиянии рекомбинантных генов человека vegf165, gdnf и ncam1 на фенотипические характеристики генетически модифицированных лейкоцитов, характер экспрессии генетически модифицированными лейкоцитами цитокинов, хемокинов и факторов роста и на транскриптомный профиль генетически модифицированных лейкоцитов, одновременно сверхэкспрессирующих VEGF, GDNF и NCAM. Полученные результаты в экспериментах in vitro и in vivo позволят сделать выводы о биобезопасности аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного рекомбинантным генетическим материалом, для персонифицированной прецизионной генной терапии.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
За данный период действующего Соглашения с 4 августа 2022 г. по 30 июня 2023 г. решались следующие задачи: на фоне внутривенной инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного рекомбинантным генетическим материалом, у мини-свиней с ишемическим инсультом головного мозга исследовали (1) миграцию генетически модифицированных лейкоцитов в головной мозг и органы иммунной защиты, (2) содержание цитокинов, хемокинов и факторов роста в крови и ликворе животных и (3) патоморфологическое изменения нервной ткани в периинфарктной области. В связи с вышеизложенным нами были выполнены следующие конкретные работы и достигнуты соответствующие результаты: I. Наработка в препаративных количествах генетических векторов на основе рекомбинантных репликативно-дефектных аденовирусов человека 5 серотипа (Ad5) с модифицированным фибером (Ad5/35F), несущих кДНК рекомбинантных генов человека vegf165, gdnf и ncam1. 1. Согласно договору № 17/ЭлА/2023 на базе Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н. Ф. Гамалеи (г. Москва) были наработаны образцы рекомбинантных репликативно-дефектных химерных аденовирусных векторов (Ad5/F35), несущих по отдельности: 1) кДНК гена, кодирующего сосудистый эндотелиальный фактор роста (Ad5/F35-VEGF165) – в объеме 55,0 мл. 2) к ДНК гена, кодирующего ген глиального нейротрофического фактора (Ad5/F35-GDNF) – в объеме 47,3 мл. 3) кДНК гена, кодирующего ген нейрональной молекулы адгезии (Ad5/F35- NCAM1) – в объеме 38,7 мл. Спектрофотометрическим методом установлено, что количество частиц рекомбинантных векторов в препаратах опытных образцов составляло: для опытного образца Ad5/F35-VEGF165 – 2,0 ОЕ, для опытного образца Ad5/F35-GDNF – 1,6 ОЕ, для опытного образца Ad5/F35- NCAM1 – 1,9 ОЕ. Специфическая активность опытного образца Ad5/F35-VEGF165 составляла 1,5×109 БОЕ/мл, для опытного образца Ad5/F35-GDNF составляла 1,8×109 БОЕ/мл, опытного образца Ad5-NCAM1 – 1,2×109 БОЕ/мл. Образцы Ad5/35F-GFP, несущего кДНК гена зеленого флуоресцирующего белка (GFP), были наработаны на предыдущих этапах исследования. Количество частиц рекомбинантных векторов в препаратах опытных образцов Ad5/35F-GFP составляло – 1,8 ОЕ, специфическая активность ‒ 1,9×109 БОЕ/мл. II. Исследование миграции генетически модифицированных лейкоцитов в организме мини-свиньи после моделирования ишемического инсульта головного мозга на фоне внутривенной инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного геном репортерного зеленого флуоресцирующего белка (gfp). GFP-позитивные клетки были обнаружены в левом полушарии головного мозга в очаге инфаркта у мини-свиней, которым внутривенно вводили аутологичный лейкоконцентрат, обогащенный геном gfp за 2 суток до моделирования инсульта (превентивная генная терапия) и через 4 часа после моделирования инсульта (генная терапия в острую фазу). В правом полушарии в обеих экспериментальных группах GFP-позитивные клетки отсутствовали. При исследовании поднижнечелюстных лимфатических узлов и селезенки GFP-позитивные клетки обнаружены в обеих опытных группах. Выявленные морфологические изменения в области ишемического повреждения мозга, а также в поднижнечелюстных лимфатических узлах и селезенке подопытных животных не связаны с внутривенной инфузией аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного геном gfp. III. Анализ патоморфологических изменений в периинфарктной области головного мозга мини-свиней через 3 недели после моделирования ишемического инсульта на фоне внутривенной инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного рекомбинантными генами человека vegf165, gdnf и ncam1: (1) за 2 суток до моделирования инсульта (превентивная генная терапия); (2) через 4 часа после моделирования инсульта (генная терапия в острую фазу). Анализ фронтальных срезов коры головного мозга, окрашенных гематоксилином и эозином, обнаружил различные патоморфологические изменения в периинфарктной зоне экспериментальных животных. Окраска срезов по Нисслю у животных из контрольной группы были найдены нейроны с различными признаками дегенерации (кариолизис, вакуолизированная цитоплазма). Субстанция Ниссля была мелкозирнистой, либо не просматривалась. В периинфарктной зоне коры больших полушарий животных из контрольной группы были найдены нейроны с выраженными признаками дегенерации (кариолизис, вакуолизированная цитоплазма), субстанция Ниссля была мелкозирнистой, либо не просматривалась. В группах с генной терапией в острую фазу и превентивной генной терапией тигроидное вещество в нейронах периинфарктной зоны было сохранено. Методом импрегнация серебром в контрольной группе в периинфарктной зоне коры больших полушарий отростки нейронов были фрагментированы или отсутствовали. У подопытных животных из группы с генной терапией в острую фазу и группы на фоне превентивной генной терапией в периинфарктной зоне больших полушарий нейроны имели хорошо сохранившиеся отростки. Морфометрическое исследование микропрепаратов, окрашенных по Массону, выявил значимое увеличение количества капилляров в группе животных на фоне превентивной генной терапии, при сравнении с интактными животными и мини-свиньями из контрольной группы. VI. Мультиплексный анализ цитокинов, хемокинов и факторов роста в крови подопытных животных через 1, 2 и 3 недели и в ликворе через 1 неделю после инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного рекомбинантными генами человека vegf165, gdnf и ncam1: (1) за 2 суток до моделирования инсульта (превентивная генная терапия); (2) через 4 часа после моделирования инсульта (генная терапия в острую фазу). Для анализа содержания цитокинов, хемокинов и факторов роста в исследуемых образцах использовали технологию мультиплексного анализа xMAP Luminex с помощью набора MILLIPLEX MAP Porcine Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Immunology Multiplex Assay и двухлучевого анализатора Bio-Plex 200 Systems with Luminex xMap Technology. Анализ цитокинов, хемокинов и факторов роста в крови у мини-свиней через 7 и 14 суток не выявил значимых отличий между опытными и интактной группами животных. Через три недели эксперимента одновременный анализ содержания GM-CSF, IL-1ra, IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, TNFα, IFNγ, IL-1β, IL-1α, IL-4, и IL-8 в крови и спинномозговой жидкости не выявил существенных различий в показателях исследуемых медиаторов воспаления во всех образцах. Таким образом, содержание основных провоспалительных (IL-1, IL-6 и TNF-α) и противовоспалительных (IL-10, IL-12) цитокинов в крови на всех сроках эксперимента и спинномозговой жидкости через з недели после моделирования инсульта у контрольных и мини-свиней из терапевтических групп были одинаковыми по сравнению с интактными животными. Эти данные свидетельствуют о прекращении воспалительной реакции уже на первой неделе после моделирования инсульта. Таким образом, полученные в ходе настоящего исследования результаты о миграции генетически модифицированных лейкоцитов в головной мозг и органы иммунной защиты мини-свиньи после моделирования ишемического инсульта головного мозга на фоне внутривенной инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного геном зеленого флуоресцирующего белка (gfp), а также анализ патоморфологических изменений в периинфарктной области головного мозга мини-свиней и мультиплексное профилирование цитокинов, хемокинов и факторов роста в крови и спинномозговой жидкости у мини-свиней через 3 недели после моделирования ишемического инсульта на фоне внутривенной инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного рекомбинантными генами человека vegf165, gdnf и ncam1, позволяют сделать предварительное заключение о биобезопасности внутривенной инфузии аутологичного лейкоконцентрата, трансдуцированного химерным аденовирусным вектором Ad5/F35, для терапии ишемического инсульта у мини-свиней в острую фазу и для превентивной генной терапии. Таким образом, все заявленные за отчетный период задачи выполнены, а ожидаемые результаты получены.

 

Публикации

1. Маркосян В.А., Измайлов А.А., Соколов М.Е., Валиуллин В.В., Сафиуллов З.З. Модель мелкоочагового ишемического инфаркта головного мозга как основа для разработки новых методов терапии инсульта Казанский медицинский журнал, Т. 104. - №2. - C. 242-248 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.17816/KMJ112404

2. Сафиуллов З.З., Измайлов А.А., Соколов М.Е., Маркосян В.А., Кундакчян Г.Г., Гарифулин Р.Р., Шмаров М.М., Народитский Б.С., Логунов Д.Ю., Исламов Р.Р. Autologous Genetically Enriched Leucoconcentrate in the Preventive and Acute Phases of Stroke Treatment in a Mini-Pig Model Pharmaceutics, Pharmaceutics 2022, 14(10), 2209 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/pharmaceutics14102209

3. Петрова В.П., Сираева А.Р., Гайнуллин И.И., Ахметов Р.Х., Минязева И.С., Яппарова К.Р., Трофимов Д.А., Маркосян В.А., Исламов Р.Р., Сафиуллов З.З. Влияние аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, на ремоделирование нейроглии в головном мозге мини-свиней с ишемическим инсультом Гены & Клетки, Гены & Клетки XVII, №3, 2022 (год публикации - 2022)

4. Исламов Р.Р., Соколов М.Е., Фадеев Ф.О., Маркосян В.А., Измайлов А.А., Кузнецов М.С., Лисюков А.Н., Гарифулин Р.Р., Давлеева М.А., Сафиуллов З.З., Баширов Ф.В., Щербинин Д.Н., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю., Народицкий Б.С. Фармацевтическая композиция и способ ее использования для терапии повреждений головного и спинного мозга -, 2784233 (год публикации - )