КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 22-75-10150

НазваниеРазработка фундаментальных основ создания и практического применения в биологии и медицине гибридных мультифункциональных наноразмерных структур на основе магнитных наночастиц

РуководительБычкова Анна Владимировна, Кандидат химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 07.2022 - 06.2025 

Конкурс№71 - Конкурс 2022 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-109 - Клиническая лабораторная диагностика и нанотехнологии в медицине

Ключевые словамагнитные наночастицы, сывороточный альбумин, соматостатин, октреотид, фолиевая кислота, биовектор, биосовместимость, адресная доставка, лекарственное вещество, противоопухолевая активность, гемцитабин, тераностика

Код ГРНТИ31.27.51

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Проект направлен на создание гибридных систем для нацеленного транспорта к клеткам-мишеням, в том числе, с целью доставки лекарственных веществ, на базе развитых научных представлений о поведении магнитных наночастиц (МНЧ), способах неспецифического и специфического узнавания наносистем при наличии на их поверхности соответствующих векторов. Магнитные наночастицы в составе систем создают предпосылки для магнитоуправляемости, определяемой размером и количеством частиц, и делают возможным совмещение принципов терапии и диагностики, биовекторы – реализацию активной стратегии доставки систем в биологические мишени и рецептор-опосредованный эндоцитоз, а применение сывороточного альбумина создаст возможность транспорта широкого спектра лекарственных веществ (ЛВ) при одновременном преодолении нежелательной адсорбции на нем компонентов крови. Впервые работы по закреплению биовекторов (октреотида и фолиевой кислоты) на поверхности магнитных наночастиц и транспорту ЛВ будут осуществлены в отношении покрытия из сывороточного альбумина, сшитого по свободнорадикальному механизму по методикам, разработанным членами коллектива. Будут проведены работы по закреплению на поверхности МНЧ антител. Впервые в отношении систем состава «МНЧ+ЧСА+биовектор», предназначенных для транспорта ЛВ, будут проведены первичные исследования устойчивости и инертности функционального слоя к действию белков, имеющих высокое содержание в крови (фибриногена и иммуноглобулина G), также будет оценен состав их белковой короны; проводимые исследования будут нести как прогностическую функцию о поведении систем в организме и возможности их связывания с рецепторами в организме, так и способствовать появлению новых знаний о поверхности раздела нано-био. Будет исследована возможность когличественной оценки связывания гибридных систем с клетками по изменению их магнитоуправляемости. Возможность транспорта ЛВ будет исследована на примерах таких препаратов как гемцитабин, таксол (паклитаксел) и таксотер (доцетаксел), а также новых соединений стероидного ряда, ориентированных на терапию рака предстательной и поджелудочной железы. Впервые полученные системы будут исследованы на моделях рака предстательной и поджелудочной железы, рака яичника, меланомы in vivo с целью получения данных об их биораспределении, накоплении в опухолях, терапевтическом действии и выведении из организма. Впервые будет оценена возможность использования такого подхода для терапии рака предстательной и поджелудочной железы.

Ожидаемые результаты
В рамках проекта будут проведены работы по синтезу и модификации магнитных наночастиц магнетита сывороточным альбумином и молекулами-биовекторами (октреотидом, фолиевой кислотой, антителами), а также включению лекарственных веществ в состав белкового покрытия. Выполнение проекта предполагает использование как традиционных, так и новых, ранее разработанных или разрабатываемых членами коллектива заявки методов и подходов. Ряд исследований будет проводиться впервые не только в России, но и за рубежом и будет обладать фундаментальной новизной. Так, впервые при создании наноразмерных функциональных систем терапевтического и диагностического назначения поверхность наночастиц будет модифицирована сывороточным альбумином с использованием свободнорадикального подхода, основанного на способности этого белка образовывать межмолекулярные сшивки под действием активных форм кислорода (АФК) и поверхности наночастиц магнетита к генерации АФК. При создании покрытия впервые будут варьироваться условия адсорбции и сшивания белка, которые могут влиять как на биосовместимость покрытия, так и на эффективность связывания с сывороточным альбумином лекарственных веществ. Выявлению вышеупомянутой корреляции с использованием комплекса физико-химических методов будет посвящено часть работ по проекту. При выполнении проекта впервые in vitro будет исследовано взаимодействие с наносистемами белков, в высокой концентрации представленных в кровотоке (иммуноглобулина G и фибриногена) и участвующих в образовании белковой короны in vivo. Также будет проведена оценка связывания других белков крови наносистемами. Эти работы будут способствовать дизайну белкового покрытия, оптимального для транспорта лекарственных веществ к биологическим мишеням, а также дополнять фундаментальные представления о границе раздела нано-био. В качестве основных исследуемых модельных лекарственных веществ будут выбраны гемцитабин и новое стероидное соединение (Алсевирон или LA-91), дополнительных - таксол, таксотер, доксорубицин. Для связывания лекарств с поверхностью систем будут использованы ковалентные и нековалетные стратегии, реакции «гость-хозяин» с производными бета-циклодекстрина. Выбор в качестве биовекторов фолиевой кислоты и аналога соматостатина октреотида позволит использовать современный исследовательский опыт присоединения биовекторов к наносистемам (для обоих биовекторов в литературе продемонстрировано сохранение функциональных свойств при ковалентном связывании с наносистемами и узнавание рецепторами-мишенями). Ожидается, что в результате выполнения проекта впервые в России будут получены наносистемы на основе магнитных наночастиц с биовекторами для доставки лекарственных противоопухолевых веществ, в том числе, к рецепторам фолиевой кислоты и соматостатина. Также ожидается впервые получение количественной информации о связывании наносистем с клетками по их отклику на магнитное поле. Впервые будет изучена возможность таргетной доставки лекарственных веществ к клеткам-мишеням опухолевых тканей систем на основе магнитных наночастиц с биосовместимым покрытием из ЧСА, не разрушающимся в кровотоке при столкновении с физическими и биохимическими препятствиями. Ожидается, что в рамках проекта будет успешно реализована возможность таргетной доставки ЛВ к клеткам-мишеням опухолевых тканей с использованием биологических векторов – октреотида и фолиевой кислоты – на моделях животных. Будут разработаны системы, оказывающие терапевтическое действие на опухоли, и продемонстрировано замедление роста опухолей под действием разрабатываемых систем. Будет доказана возможность эффективного транспорта новых стероидных соединений к опухолевым клеткам и подавления патологических процессов. Ожидается, что противоопухолевый эффект будет реализован как за счет непосредственного токсического действия на опухолевые клетки цитостатиков, входящих в гибридную систему, так и за счет эмболизирующего действия наночастиц в сосудах опухолей. В качестве дополнительного терапевтического воздействия на опухоли может быть реализована гипертермия. Ожидается реализация контрастирующих свойств новых гибридных систем на основе магнитных наночастиц при МРТ и КТ исследованиях.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Были синтезированы магнитные наночастицы (МНЧ) со средними диаметрами 21-23 нм и 38-44 нм по данным метода динамического светорассеяния (ДСР) (с подтверждением размеров частиц методом NTA). Закрепление на поверхности МНЧ сывороточного альбумина было проведено адсорбционно и с использованием разработанного ранее членами коллектива свободнорадикального подхода. С применением разработанного ранее теста с использованием конкурентных адсорбционных процессов с участием иммуноглобулина G (IgG) и применением методов электронного магнитного резонанса (ЭМР), спектрофотометрии, ДСР было подтверждено получение более устойчивых покрытий из ЧСА на поверхности МНЧ при окислении (причем как при окислении на поверхности МНЧ, так и при окислении в растворе) по сравнению с покрытиями, получаемыми из неокисленного альбумина. Выявлены концентрационные диапазоны получения устойчивых покрытий на МНЧ из неокисленного альбумина при использовании и без использования пероксида водорода как инициатора генерации АФК, а также из окисленного альбумина. Выявлен эффект экранирования белками поверхности МНЧ и снижения активности частиц в реакциях генерации гидроксильных радикалов, что может иметь место при создании и применении гибридных белок-содержащих покрытий на МНЧ для тераностики опухолей. Проведен комплекс работ по модификации поверхности МНЧ, покрытых ЧСА, молекулами, обладающими противораковым действием (доксорубицин, таксотер или таксол), в том числе, с анализом возможностей применения методики создания комплексов включения «гость-хозяин» на ЧСА. Контроль связывания ЛВ с поверхностью частиц проводили методами спектрофотометрии и спектрофлуориметрии по несвязанным веществам. Таким образом, было выявлено наличие совокупности сложноразличимых целевых и нецелевых процессов модификации поверхности МНЧ лекарственными веществами, что сделало нецелесообразными дальнейшее количественное описание эффективности связывания ЛВ в присутствии и в отсутствии бЦД, а также широкие эксперименты по введению полученных гибридных систем in vivo, оценку ингибирования роста опухоли у крыс и мышей и визуализации опухолей на данном этапе работы, а также привело к постановке новых целей и задач и внесению необходимых изменений в планы работ в рамках тематики проекта, а именно разработки фундаментальных основ создания гибридных мультифункциональных наноразмерных структур на основе магнитных наночастиц для их дальнейшего биомедицинского применения. Для проведения первых исследований по связыванию с ЧСА были синтезированы производные лекарственного вещества стероидного ряда LA-91 (мизолакрона)), а также конъюгаты гемцитабина со стеариновой кислотой. Было качественно доказано связывание стеариновой кислоты с сывороточным альбумином и проведены работы на модельном препарате стероидного ряда, подтверждающие необходимость дополнительной модификации молекулы ЛВ. Получены первые данные, свидетельствующие о влиянии связывания ЧСА со стеариновой кислотой на интенсивность спектров 16-ДСК. Начата разработка методических основ количественной оценки связывания ЛВ, модифицированных стеариновой кислотой, с гибридными частицами. Получены первые полуколичественные результаты по связыванию фолиевой кислоты с белком на поверхности МНЧ через синтез сукцинимидного производного. Для связывания мФК с поверхностью МНЧ, модифицированных ЧСА, были апробированы три стратегии: (1) конъюгация ЧСА с фолиевой кислотой и последующее закрепление конъюгата на поверхности МНЧ; (2) одновременное связывание ЧСА и мФК с поверхностью МНЧ; (3) получение устойчивого покрытия из ЧСА на поверхности МНЧ с последующим связыванием с частицами фолиевой кислоты. Тогда как несомненным достоинством первой стратегии является простое подтверждение связывания мФК с ЧСА, при реализации этого способа есть существенный недостаток – экспериментально выявленная нестабильность покрытия из конъюгата на МНЧ, требующая включения дополнительных стадий отмывки конъюгата от ДМСО. Вторая и третья стратегии были сопоставлены по следующим параметрам: агрегативная устойчивость получаемых частиц; устойчивость белкового покрытия. Третья стратегия имела существенное достоинство в виде возможности снижения расходования мФК (как прототипа биологически активного соединения, модифицированного до сукцинимидного эфира для связывания с альбумином). С применением третьей стратегии были получены устойчивые покрытия с расчетным соотношением мФК:ЧСА=14:1 (моль/моль). Доказана стабильность дисперсии частиц в течение 14 дней. Впервые для анализа устойчивости покрытий различного состава, в том числе, после модификации поверхности гибридных систем фолиевой кислотой, наряду с разработанным ранее тестом с использованием иммуноглобулина G, был применен тест с использованием плазмы крови. Оценку возможности связывания белков крови с поверхностью наночастиц, покрытых модифицирующим слоем, осуществляли с применением метода электронного магнитного резонанса. Первично доказана детектируемость гибридных систем, полученных с использованием конъюгата ЧСА-Cy5, на модельной клеточной линии карциномы молочной железы человека MCF-7 методом конфокальной микроскопии. Получены экспериментальные подтверждения входа наносистем в клетку. Проведены оценки возможности колокализации наночастиц с Су5 на их поверхности при помощи подтверждения спектральных характеристик Су5-конъюгата и в конфокальной микроскопии при разделении сигналов с зелеными трекерами органелл. Сигналы разделимы на микроскопе Leica SP5. По результатам исследования цитотоксичности построены кривые выживаемости и оценено достижение IC50 (концентрации, необходимой для гибели 50% клеток). Показано, что при концентрации наноночастиц на уровне около 160 мкг/мл цитотоксичность превышает наблюдаемую для наносистем (при той же концентрации по магнетиту). Выживаемость клеток при наносистемах составляет около 80%. Частицы можно считать инертными до конечных концентраций 40 мг/л и использовать образец в этом диапазоне концентраций как носитель для цитостатиков. Местное внутриартериальное введение гибридных наносистем в опухоли животных (на внутримышечно трансплантированном РС-1 у крыс) (от 20 до 60 мкг частиц на животное из дисперсии с концентрацией до 200 мкг/мл по МНЧ) показали возможность длительного нахождения частиц в опухоли (более 14 дней) при визуализации их методом компьютерной томографии, что демонстрирует для гибридных систем возможность быть использованными для длительного высвобождения лекарственных веществ в опухоли. Патоморфологический контроль подтвердил эффективность введения систем. В контрольной группе общая площадь некроза составила 25-30% опухоли. В группе эксперимента отмечено двукратное увеличение: площадь некроза составила в разных срезах от 50-75% опухоли. Работы с РС-1 показали закупорку сосудов (эмболизацию) и замедление роста опухоли. Была проведена оценка чувствительности подхода, основанного на применении метода ЭМР для выявления присутствия МНЧ в органах и других биоматериалах животных. На данной стадии разработки метод чувствителен к массам от 40 нг МНЧ на 1 см3 сухого образца. Основные научные результаты первого года выполнения проекта отражены в публикациях в журнале Pharmaceutics https://www.mdpi.com/1999-4923/14/12/2771 , в рукописи, подготовленной в журнал «Доклады академии наук», а также находятся на стадии подготовки к публикации; в научно-популярном стиле описаны в Интернет-изданиях Indicator.ru и MENDELEEV.INFO. Результаты работы, полученные коллективом на первом этапе выполнения проекта, будут использованы для продолжения исследований, нацеленных на разработку фундаментальных основ создания и практического применения в биологии и медицине гибридных мультифункциональных наноразмерных структур на основе магнитных наночастиц.

 

Публикации

1. Бычкова А.В., Якунина М.Н., Лопухова М.В., Дегтярев Е.Н., Мотякин М.В., Покровский В.С., Коварский А.Л., Горобец М.Г., Ретивов В.М., Хачатрян Д.С. Albumin-Functionalized Iron Oxide Nanoparticles for Theranostics: Engineering and Long-Term In Situ Imaging Pharmaceutics, 14, 2771, P. 1-15 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/pharmaceutics14122771

2. Абдуллина М.И., Горобец М.Г., Мотякин М.В., Муранов К.О., Лопухова М.В., Бычкова А.В. Изучение влияния окислительной модификации сывороточного альбумина на устойчивость белкового покрытия на поверхности наночастиц IV школа-конференция для молодых ученых «Супрамолекулярные стратегии в химии, биологии и медицине: фундаментальные проблемы и перспективы» (с международным участием) Казань, 3-6 октября 2022 г., с. 59 (год публикации - 2022)

3. Абдуллина М.И., Мотякин М.В.,Важенкова Е.Е., Каспаров В.В., А.В. Бычкова В.В. Влияние окислительной модификации на устойчивость покрытия из сывороточного альбумина на поверхности наночастиц магнетита XXII Ежегодная молодежная конференция c международным участием ИБХФ РАН-ВУЗы, C. 1-3 (год публикации - 2022)

4. Горобец М.Г., Абдуллина М.И., Мотякин М.В., Бычкова А.В. Оценка пероксидазной активности наночастиц магнетита в присутствии белков крови Труды XXII Ежегодной международной молодежной конференции "Биохимическая физика" ИБХФ РАН-ВУЗы. Москва, 14-16 ноября 2022 г., C. 1-4 (год публикации - 2022)

5. Горобец М.Г., Мотякин М.В., Абдуллина М.И., Бычкова А.В. Пероксидазная активность наночастиц магнетита в присутствии белков крови Международная зимняя молодёжная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». 7–10 февраля 2023 года. Москва, С. 1 (год публикации - 2023)

6. Горобец М.Г., Мурадова А.Г., Шарапаев А.И., Лопухова М.В., Бычкова А.В. Детекция белков "белковой короны" на поверхности магнитных наночастиц Труды XXII Ежегодной международной молодежной конференции "Биохимическая физика" ИБХФ РАН-ВУЗы. Москва, 14-16 ноября 2022 г., C. 1-3 (год публикации - 2022)

7. Торопцева А.В., Хачатрян Д.С., Горобец М.Г., Пронкин П.Г., Градова М.А., Садыкова Э.З., Абдуллина М.И., Лопухова М.Л., Колотаев А.В., Бычкова А.В. Модификация фолиевой кислотой наносистем на основе магнитных наночастиц и сывороточного альбумина Труды XXII Ежегодной международной молодежной конференции "Биохимическая физика" ИБХФ РАН-ВУЗы. Москва, 14-16 ноября 2022 г., C. 1-4 (год публикации - 2022)