Аннотация результатов, полученных в 2022 году
За первый год работы проведены все запланированные работы и получены следующие результаты: 1) Выделены и проанализированы методом МСИЦР ПФ сложные полифенольные смеси: гуминовые кислоты пелоидов (PelHA), фульвокислоты пелоидов (PelFa), гиматомелановые кислоты (PelHMA), образец окисленного гидролизного лигнина (BP-Cx-1), изофлавонов из корней кудзу, пуэрарии дольчатой (ISF), астаксантин, фракции BP-Cx-1 и гуминовые кислоты леонардита (LHA). Для всех образцов были определены от 2 до 6 тысяч молекулярных формул. Образцы сравнивались по распределению классов компонентов по индексу AIcon. Образцы пелоидов характеризовались значительным вкладом алифатических компонентов (>10%), низкой долей ароматических соединений и большим вкладом конденсированных структур с AI≥0.67. Образцы ISF, BP-Cx-1 и BP-Cx-methanol характеризовались максимальным вкладом ароматических компонентов, причем в образце ISF он был максимальным (70%). В то же время, за исключением астаксантина, метанольная фракция характеризовалась максимальный вкладом ненасыщенных соединений (>30%). Было сделано предположение, что содержание полифенолов падает в ряду ISF>(BP-Cx-methanol)>(BP-Cx-1)>остальные образцы. 2) Было исследовано влияние материала и размера частиц сорбента, применяемых для твердофазной экстракции, на молекулярный состав трех образцов: BP-Cx-1, MRNOM (растворенное вещество Миссисипи) и SRNOM (растворенное вещество Суванни). Для экстракции полифенолов были выбраны 3 полимерных гидрофобных материала с одинаковым принципом действия: PPL, Strata-X и Strata-XL. Во всех случаях количество формул в выделенных образцах превышало количество формул в исходных образцах за счет уменьшения конкуренции при ионизации. Была выявлена особенность во взаимодействии BP-Cx-1 с сорбентами: в отличие от SRNOM и MRNOM, применение всех сорбентов для выделения BP-Cx-1 приводило к уменьшению среднечисленных массы, ненасыщенности и ароматичности. Таким образом происходила потеря наиболее конденсированных компонентов, которые либо не сорбируются, либо не элюируются ни с одного из сорбентов. Для образцов SRNOM и MRNOM с помощью сорбента StrataX удалось получить наиболее близкую к исходным образцам фракцию. В случае BP-Cx-1 все сорбенты приводили к существенному изменению молекулярного состава образца. Однако, было замечено умеренное сходство между образцов BP-Cx-methanol и образцом, выделенными на StrataX. Был сделан вывод о целесообразности использования сорбента StrataX в дальнейшей работе. 3) Создана локальная MySQL копия последней версии базы данных биологической активности ChEMBL32. Записи экспериментов, содержащие слово “hepatoptotective” и соответствующие им записи об активности и структурах соединений, были извлечены в отдельный датасет (ChEMBLhepato) с использованием текстового поиска в поле assays.description. В результате были отобраны 410 000 соединений с изученными гепатопротекторными свойствами. Среди отобранных структур 397867 не обладали активностью, 1243 были активны и для 7974 активность не была надежно определена. Для получения QSAR модели были усреднены 20 моделей градиентного бустинга с балансом активных и неактивных соединений 1:3, причем неактивные соединения выбирались случайным образом из списка. Лучший результат по BA составил 0.8128. 4) Была создана объединенная база данных спектров фрагментации природных соединений методами масс-спектрометрии высокого разрешения. Для этого отбирали спектры из баз GNPS, MassBank и MoNA. В результате фильтрации по приборам и препроцессинга была собрана база из 130841 МС2 спектров для 13604 соединений. Полученные спектры использовали для обучения модели нейронной сети MS2DeepScore с измененными параметрами. Оригинальная модель преобразует бинаризованные масс-спектры в вектора-эмбеддинги размером 256. В модифицированной версии размер эмбеддингов составил 512. Для обучения сети масс-спектры базы Merged были поделены на тренировочную, валидационную и тестовую в соотношении 105к:9.5к:13к. Полученные эмбеддинги использовали для построения прогностической модели для гепатопротекции по МС2 спектрам. Была получены модель для структур с балансом классов активных и неактивных 1:10. Результирующая модель, полученная методом Случайного леса, имел BA 0.6 для спектров фрагментации. 5) Была изучена гепатопротекторная активность in vitro образцов гуминовых веществ пелоидов (PelFA, PelHA, PelHMA), BP-Cx-1 и его фракции BP-Cx-methanol, ISF, гуминовых кислот леонардита (LHA) и экстракта Мускуса бобрового, БМ. Гепатопротекторная способность исследуемых многокомпонентных смесей природного происхождения определялась в культуре клеток гепатоцитов HepG2 при помощи МТТ-колориметрического теста цитотоксичности. Для изучения гепатопротекторной активности кандидатных веществ in vitro клеточную линию HepG2 инкубировали в 96-луночном планшете с гепатотропным ядом – тетрахлорметаном CCl4. Для всех образцов был рассчитан показатель 50%-ой эффектвной дозы (ED50). В результате образцы PelFA и БМ не проявили гепатопротекторной активности. Для образцов BP-Cx-1 и его фракции получили достаточно высокую активность: 236,9988 мкг/мл и 196,5407 мкг/мл для ED50, соответственно. Образец ISF оказался наиболее активным с ED50 87,1657 мкг/мл. Таким образом, ISF являлся наиболее активным гепатопротектором, активность которого объясняется пуэрарином. Фракция BP-Cx-methanol оказалась активней исходного образца BP-Cx-1, видимо, за счет обогащения ароматическими компонентами - полифенолами. 6) Для двух активных образцов (BP-Cx-1, ISF) и одного образца сравнения (PelHA) была проведена оценка гепатопротекторной активности in vivo на модели «подострого» поражения печени у самок мышей линии BALB/c. В исследовании участвовали 63 мыши, разбитые на 5 групп: интактный контроль, негативный контроль, CCl4+ISF, CCl4+PelHA и CCl4+BP-Cx-1. За мышами вели клинический осмотр, в последний день эксперимента в метаболических камерах была собрана суточная моча для дальнейших исследований. После эвтаназии проведено исследование массовых индексов внутренних органов, сравнение их размеров, проведены общий клинический и биохимический анализ крови. Было проведено гистологическое исследование печени для оценки уровня стеатоза и наличия фиброза. В результате биохимического анализа было показано уменьшение индекса де Ритиса у группы негативного контроля, что могло свидетельствовать о начале развития гепатита. Было показано повышение индекса в группах, получающих терапию. По результатам гистологического исследования печени определены индексы стеатоза во всех группах животных. Гистологическое исследование показало выраженный микровезикулярный стеатоз печени у всех мышей, получавших CCl4. На данной модели повреждения печени индекс стеатоза не различался между интактным контролем (0,46±0,18) и группой «5. CCl4 + ISF» (0,58±0,23). Отличие от группы «4. CCl4 + BP-Cx-1» (1,27±0,24) было также незначительным. При окрашивании печени по Масону не обнаружено существенных различий в содержании коллагеновых волокон между опытными и контрольной группами; на данном сроке исследований фиброз не диагностировался. Можно заключить, что результаты оценки гепатопротекторной активности in vivo и in vitro для трех перпаратов показали похожие тренды. 7) В рамках проекта разработана новая методология анализа и визуализации данных МСИЦР ПФ с использованием топологического анализа данных. Методология была апробирована на 9 образцах сложных смесей, изученных в первый год выполнения проекта. Для 9 образцов был сгенерирован топологический граф и была показана возможность использования графа для иллюстративного анализа молекулярного состава образцов. Для анализа и классификации тех же 9 образцов был применён метод персистентной гомологии. Была показана эффективность применения данного метода для сравнительного анализа образцов разной природы. Был обнаружено, что при свертке, образцы BP-CX-1, и изофлавоны (проявляющие активность) значительно отличаются от неактивных образцов по топологическим характеристикам.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В рамках второго года проекта были проведены мультиомиксные исследования (протеом и метаболом) и были проанализированы по 62 образца мочи и печени мышей-самок линии BALB/с, получавших потенциальные гепатопротекторы в модели подострого поражения печени четыреххлористым углеродом (CCL4) in vivo. Анализ метаболома мочи животных с подострым повреждением печени выявил существенные различия между образцами мочи из группы интактного контроля, негативного контроля, а также группы, получавшей изофлавоноиды, проявившие наилучший гепатопротекторный эффект in vivo. Дополнительно к изначальному плану исследования была выделена и проанализирована протеомная фракция мочи и печени. В целом, по результатам исследования молекулярного состава (метаболом, протеом) образцов от экспериментальных животных в модели подострого поражения печени было показано, что обнаруженная на первом году реализации проекта гепатопротекторная эффективность исследуемых многокомпонентных смесей природного происхождения сопровождается закономерными изменениями метаболомного и протеомного профиля состава мочи и печени. Описываемые изменения наиболее выражены при применении изофлавонов из корней кудзу (ИЗФ), что хорошо коррелирует с относительной эффективностью препаратов, зафиксированной на предыдущем этапе проекта в исследованиях in vitro и in vivo. Возможно, данное преимущество связано с более низкой молекулярной массой активных изовлавоноидов по сравнению с компонентами полифенольного препарата BP-Cx-1. В связи с этим, для выполнения исследования второго года реализации проекта была выделена потенциально более активная фракция BP-Cx-1 методом экстракции в метаноле. Было продолжено усовершенствование модели MS2DeepScore для анализа тандемных масс-спектров, полученных в режиме отрицательных ионов. Были полученны эмбеддинги, которые использовались для обучения модели предсказания химических классов соединений и гепатопротекторной активности. На данном этапе проекта удалось значительно улучшить данное обучение за счет подбора гиперпараметров модели классификатора с помощью вложенной кросс-валидации. За счет использования кросс-валидации к обучению классификатора и тестированию эмбеддингов тандемных масс-спектров удалось значительно увеличить целевую метрику Balanced Accuracy для некоторых классов химических соединений, представленных в тестовой выборке для спектров, полученных в режиме положительных ионов. Например, для класса липидов Balanced Accuracy составило 0.83+- 0.0073 по сравнению с 0.6, полученном на предыдущем этапе. Было проведено тестирование потенциальной мутагенной активности многокомпонентных смесей природного происхождения (ГК, BP-Cx-1, BP-Cx-1-methanol, ИЗФ) в тесте Эймса, которое продемонстрировало отсутствие мутагенной активности у всех исследуемых веществ в максимальной концентрации 5000 мкг/мл как в условиях метаболической активации, так и без нее. Было проведено исследование потенциальной генотоксической и антиоксидантной активности многокомпонентных смесей природного происхождения in vivo (на 25 самцах мышей F1 - CBAхC57Bl/6). По результатам данного исследования in vivo можно сделать заключение о низком риске проявления нежелательного генотоксического эффекта при использовании всех исследованных многокомпонентных смесей, а также о наличии положительного влияния на состояние антиоксидантной системы у препаратов гуминовых кислот и производных лигнина. Также по результатам пилотного исследования возможных аллергизирующих свойств многокомпонентных смесей природного происхождения ex vivo можно заключить, что исследуемые многокомпонентные смеси природного происхождения являются аллергобезопасными. Было проведено исследования гепатопротекторной активности многокомпонентных смесей природного происхождения in vivo на модели неалкогольной жировой болезни печени. Проведенное исследование показало, что изученные многокомпонентные смеси природного происхождения обладают выраженной гепатопротекторной эффективностью. Так, использование BP-Cx-1 и, в большей степени, выделенной метанольной фракции увеличивало выживаемость экспериментальных животных, уменьшало степень повреждения печени, способствовало нормализации содержания в сыворотке крови экспериментальных животных АСТ, АЛТ, билирубина. Применение изофлавоноидов не влияло на выживаемость мышей, но в остальном оказывало сходное гепатопротекторное действие. Кроме того, обнаружено антигенотоксическое действие исследуемых композиций, более выраженное у метанольной фракции BP-Cx и изофлавоноидов, использование которых снижало уровень ДНК-комет в гепатоцитах экспериментальных животных в 2 раза. Гепатопротекторная активность многокомпонентных смесей, выявленная на первом году реализации проекта на модели подострого поражения печени с помощью CCl4 in vivo, была подтверждена в текущем году на модели НАЖБП, вызванной сочетанием стрептозотоцина с высокожировой и высокофруктозной диетой. При этом использованная модель НАЖБП приводила к большим нарушениям: так, наблюдалась смертность животных, увеличение индекса стеатоза до 2,43±0,30 баллов, развитие микро и макровезикулярного стеатоза (ранее фиксировали только микровезикулярный вариант). При этом в модели с использованием CCl4 было обнаружено статистически значимое снижение поражения печени при использовании BP-Cx-1 и полная нормализация значения показателя при применении ИЗФ; в более «жесткой» модели НАЖБП полученное снижение индекста стеатоза на 39-43% не достигало уровня статистической значимости во всех экспериментальных группах с лечением. При использовании CCl4 в подострой модели не наблюдалось значимых изменений показателей белкового обмена, а увеличение содержания ферментов фиксировалось только для АЛТ. При моделировании НАЖБП изменялось содержание основных фракций белка, наблюдалось повышение уровня как АЛТ, так и АСТ, а также общего и прямого билирубина, что позволило установить нормализующее влияние исследуемых многокомпонентных смесей на значения данных показателей. В рамках проекта была разработана методология анализа информации о биологической активности и, в частности, гепатопротекторной активности с использованием подхода предложенного [Vegupatti, Nickles, Chakravarthi, 2020]. В качестве улучшения вышеописанного подхода, была имплементирована возможность использования нескольких баз данных (ChEMBL, DurgBank), представленных в формате субъект-предикат-объект (RDF) для одновременного поиска по обоим графам знаний. Добавлен поиск по синонимам, позволяющий учитывать грамматические ошибки или различное написание слов, а также часть, связанная с обработкой химических структур, включающая стандартизацию, конвертацию и структурный поиск по подобию химических соединений. Для выборки гепатопротекторных соединений, извлеченных из базы данных ChEMBL, данные о гепатопротектороной активности и структурах химических соединений были стандартизованы и использованы для создания новых предикатов (активность, изученность). Был сформирован список вопросов для новых предикатов. Кроме того, была исследована возможность систематической генерации дополнительных вопросов с использованием большой языковой модели ChatGPT-3.5. Было проведено сравнение вопросно-ответной системы с большими языковыми моделями ChatGPT-3.5, ChatGPT-4, дообученными с использованием подходов zero and few-shot learning (обучение без примеров и обучение с небольшим количеством примеров). Было показано, что разработанная модель позволяет достичь высокой точности субъекта (0.988) и предиката (0.934). При этом относительно дефолтной модели точность нахождения субъекта выросла с 0.822 до 0.988, а предиката с 0.902 до 0.934. Однако разреженность графа знаний, построенного с использованием только информации из DrugBank и ChEMBL приводит к отсутствию ответов на вопросы про новые или относительно менее изученные биологически активные соединения. Дальнейшая комбинация разработанной методологии с большими языковыми моделями, а также методами оценками неопределённости больших языковых моделей, например, в варианте генерации с использованием извлечения данных (Retrieval-Augmented Generation), может позволить улучшить разработанный подход с точки зрения полноты и фактологической точности ответов. На текущем этапе произошла смена руководителя проекта, однако все запланированные работы выполнены в полном объеме, также проведены дополнительные исследования в связи с компетенциями нового руководителя (протеомный анализ мочи и печени), по результатам проделанных работы готовятся публикации.