КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 22-74-10109
НазваниеКомбинаторное мечение клеток флуоресцентными белками со сверхвысоким разнообразием в опухолевых моделях
РуководительМамонтова Анастасия Вячеславовна, кандидат наук (признаваемый в РФ PhD)
Организация финансирования, регион Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования «Сколковский институт науки и технологий», г Москва
| Период выполнения при поддержке РНФ | 07.2022 - 06.2025 |
Конкурс№71 - Конкурс 2022 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология
Ключевые словаBrainbow, FLIM, флуоресцентная микроскопия, флуоресцентные белки, флуоресцентное мечение, клеточная гетерогенность, многопараметрическая микроскопия
Код ГРНТИ34.15.05
СтатусЗакрыт досрочно
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Отслеживание отдельных клеток и клеточных линий в пространстве и времени востребовано во многих биологических моделях в нейробиологии, эмбриологии, онкологии и других областях. Флуоресцентные белки позволяют генетически кодировать флуоресцентные метки в клетках, однако одновременно возможно использовать только несколько различных цветов в качестве уникальных маркеров. Для решения этой проблемы в 2007 году была предложена технология Brainbow. В ней используется рекомбинация Cre/lox для создания стохастического выбора экспрессии между тремя ФБ разных цветов (например, синим, зеленым и красным, аналогично цветовому коду RGB в компьютерных мониторах). Комбинаторная экспрессия трех ФБ позволяет создать около 100 различимых цветов клеток. Данное разнообразие является недостаточным для полноценного анализа крупных образцов тканей и не может быть масштабировано для совместного использования с современными высокопроизводительными омиксными технологиями. Таким образом, применение метода Brainbow ограничено небольшими субпопуляциями клеток.
Для решения этой проблемы мы предлагаем новый подход «FLIMbow», который сочетает идею мечения Brainbow с активно развивающимся методом микроскопии — FLIM (микроскопия визуализации времени жизни флуоресценции). Ранее было показано, что FLIM может различать метки одного цвета, имеющие разное время жизни флуоресценции [1, 2]. Мы предполагаем, что использование для мечения клеток комбинации трех ФБ с разными временами жизни, а не цветами, позволит достичь аналогичного Brainbow результата, используя лишь белки одного флуоресцентного канала. Более того, предложенную концепцию мы планируем расширить до трех каналов. Таким образом, сочетание девяти ФБ в трех цветовых каналов позволит получить до миллиона (100*100*100) уникальных комбинаций, многократно расширяя границы оригинального метода Brainbow и области его применения. Валидация новой технологии будет выполнена в экспериментах по наблюдению клональной эволюции в опухолевых моделях.
Таким образом, в результате выполнения проекта будет создана уникальная технология многоцветного флуоресцентного мечения клеток с помощью комбинаций генетически-кодируемых флуоресцентных белков с различными характеристиками спектров и затухания флуоресценции.
Цитируемая литература:
1. E. M. Merzlyak, et al., Bright monomeric red fluorescent protein with an extended fluorescence lifetime. Nat Methods. 2007 Jul;4(7):555-7. doi: 10.1038/nmeth1062
2. A. V. Mamontova, I. D. Solovyev, A. P. Savitsky, A. Shakhov, K. A. Lukyanov, and A. M. Bogdanov, “Bright GFP with subnanosecond fluorescence lifetime,” Sci. Rep., vol. 8, no. 1, pp. 1–5, 2018.
Ожидаемые результаты
В данном проекте мы разработаем новый мощный метод окрашивания тканей и органов с помощью генетически кодируемых флуоресцентных белков с возможностью различения до миллиона окрашенных в псевдоцвета клеток. Данный метод может найти применение в различных областях биологии и биомедицины, связанных с необходимостью прижизненного наблюдения гетерогенности и фенотипического разнообразия клеток в составе клеточных популяций и тканей.
Его можно применять для визуализации коннектома головного мозга, поиска клеток-предшественников опухоли, наблюдения клонального развития опухоли и происхождения метастазов, исследования исчерпывающего состава здоровой ткани или опухоли на клеточном уровне, в биологии развития и многих других областях. В представленном проекте возможности новой технологии FLIMbow будут продемонстрированы при изучении динамики опухолеобразования на моделях ксенографтных опухолей мышей.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2022 году
За отчетный период в полном объеме реализованы планы, сформулированные на этапе заявки. В частности,
1. Получены и проанализированы мутантные варианты белка TagBFP - L65M и L65F1- с коротким и длинным временем жизни флуоресценции (370 и 4000 пс, соответственно). Дополнительно полученные белки были успешно протестированы во FLIM-экспериментах на культуре клеток HeLa.
2. Синтезированы генетические конструкции, содержащие последовательности синих флуоресцентных белков, чьи времена жизни ранее не были описаны - mKalama1, Sirius, Sumire (Hui-wang Ai et al, Biochemistry 2007, Kazunori Sugiura et al., Commun Biol. 2022). На данный момент проводится экспрессия и выделения данных белков для дальнейшей спектральной и времяразрешенной характеристики.
3. Сконструирован ряд библиотек мутантных вариантов флуоресцентных белков FusionRed и mKate2 с общим репертуаром около 300000 уникальных последовательностей для дальнейшего отбора по спектральным и времяразрешенным характеристикам.
4. Были отобраны 2-3 ФБ в красном (mCherry, mKate2, mScarlet), синем (TagBFP2, Azurite) и зеленом (BrUSLEE, EGFP, mTurquoise2-1710) флуоресцентных каналах, как наиболее удовлетворяющие требованиям метода.
5. Для реализации метода FLIMbow-lenti получен набор из 8 вирусных векторов, кодирующих выбранные ФБ, и на их основе получены лентивирусы. Проведены эксперименты на культуре клеток млекопитающих доказывающие работоспособность и эффективность предложенной стратегии мечения клеток.
6. Для реализации метода FLIMbow-Cre собрана генетическая конструкция с индуцируемой Cre-рекомбиназой и создана стабильная клеточная линия клеток HeLa путем транспозонного переноса генетической кассеты в геном клеток.
7. Показали эффективность использования паттерн фита для анализа немоноэкспоненциальных кривых затухания флуоресценции.
8. Провели сравнительный анализ определения клонов при мечении клеток по методу LeGO и FLIMbow в одном или трех каналах. Так FLIMbow только в одном флуоресцентном канале дает разнообразие меток, сравнимое с RGB мечением, а FLIMbow в комбинации из 8 флуоресцентных белков в трех каналах позволило с значительно большей точностью предсказывать клоны.
9. Написана основная часть ПО для анализа FLIM изображений. ПО позволяет автоматически сегментировать ядра с помощью нейронной сети и производить различные методы анализа кривых затухания флуоресценции в различных каналах. Графический интерфейс позволяет в интерактивном режиме опробовать различные методы кластеризации и их параметры, а также визуализировать большое количество метрик кластеризации.
10. Получена референсная разметка 600 клонов в 2 каналах и 180 клонов в 3 каналах. Показано что сочетание метода кластеризации BCALoD и уменьшения размерности UMAP для обработки кривых затухания позволяет с наибольшей точностью определять клоны.
11. Получены опухолевые ксенографты у мышей nude из многоцветно-меченых FLIMbow опухолевых клеток библиотечной линии. С помощью автоматической кластеризации определили, что полученные ксенографтные опухоли обладают крайне высоким уровнем клональной гетерогенности.
Публикации