КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 22-74-10043
НазваниеПрименение методов идентификации ДНК в водной среде (eDNA) для мониторинга видового разнообразия и численности водоплавающих птиц
РуководительДемин Александр Геннадьевич, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный университет", г Санкт-Петербург
| Период выполнения при поддержке РНФ | 07.2022 - 06.2025 |
Конкурс№71 - Конкурс 2022 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-210 - Молекулярная генетика
Ключевые словаэкологическая ДНК, секвенирование, ДНК-штрихкодирование, метабаркодирование, водоплавающие птицы, ПЦР, мтДНК, экологический мониторинг, экологическая генетика, митохондриальная ДНК, гены рибосомной РНК
Код ГРНТИ34.15.23
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
В настоящее время биологическое разнообразие и численность птиц, связанных с водными и околоводными экосистемами, оценивается с помощью классических методов прямого визуального наблюдения, идентификации и учёта. Естественными факторами, ограничивающими эффективность такого подхода, являются погодные условия, длина светового дня, а также лимит числа наблюдателей и времени наблюдений.
Новым инструментом, потенциально способным расширить возможности мониторинга биоразнообразия водных экосистем, стал анализ так называемой экологической или средовой ДНК (eDNA) в воде. Метод основан на детекции и анализе внеклеточной ДНК или ДНК клеточного дебриса, которая попадает в окружающую среду в результате секреции живых организмов или со слущивающимися клетками и производными кожи. Идентификация видов осуществляется по наличию видоспецифичных фрагментов ДНК, широко используемых для ДНК-штрихкодирования видов (гены митохондриальной ДНК, гены и спейсеры рибосомных повторов ядерной ДНК). При этом концентрация видоспецифичной ДНК в воде коррелирует с численностью особей данного вида. Подобный подход может быть использован как для выявления eDNA конкретных известных видов методом ПЦР в реальном времени, так и для изучения всего разнообразия организмов определенной таксономической группы – метабаркодирование, основанное на методах высокопроизводительного секвенирования. В мировой практике метод оценки биоразнообразия с помощью анализа видоспецифичной eDNA начал использоваться относительно недавно и позволил получить интересные результаты при исследовании видового разнообразия рыб, беспозвоночных и китообразных. Первые работы, направленные на изучение возможности мониторинга птиц с использованием метода eDNA начались только в 2018 году. К настоящему времени количество исследований, связанных с изучением eDNA птиц (в том числе в комплексе с другими таксонами позвоночных) крайне мало. Исследования в этой области находятся на начальном этапе и пока затрагивают преимущественно общие методические вопросы.
Предлагаемый проект направлен на апробирование и продвижение метода анализа eDNA в водной среде для изучения биоразнообразия водоплавающих и околоводных птиц. Этот метод может стать мощным инструментом биомониторинга орнитофауны северных регионов, в значительной степени представленной такими видами. Применение eDNA актуально для выявления мест миграционных стоянок водоплавающих птиц, которые носят временный характер и сложны в обнаружении без использования трудоёмких и ресурсозатратных стационарных визуальных наблюдений. Использование этого метода перспективно и для мониторинга редких и малочисленных видов птиц, регистрация присутствия которых визуальными методами часто носит случайный, субъективный характер и не способна отобразить динамику численности их популяций, а также вклад в биоразнообразие экосистемы. Предлагаемый подход может быть использован не только в комплексе с классическими методами учёта птиц, но и в качестве самостоятельного инструмента мониторинга. Это позволит существенно сократить время работ, повысить их качество и значительно снизить финансовые затраты на исследования, что особенно актуально для реализации программ многолетнего экологического мониторинга в труднодоступных северных регионах, где в последние годы наблюдается стремительное развитие нефтегазовых и инфраструктурных проектов.
В настоящем Проекте изучение возможностей и границ применения методов анализа eDNA для видовой идентификации и количественной оценки перелетных водоплавающих птиц будет выполнено на примере орнитофауны миграционных стоянок в Свирской губе Ладожского озера. В исследовании запланированы: поиск оптимальных способов забора и фильтрации образцов воды для концентрирования образцов eDNA; изучение скорости деградации eDNA птиц в природных водоемах; разработка тест-систем, основанных на методе ПЦР в реальном времени, для видовой идентификации наиболее массовых водоплавающих птиц арктического региона, мигрирующих через Ладожское озеро; разработка оптимальной панели праймеров для избирательного метабаркодирования eDNA птиц; регулярный отбор образцов воды со стационарных точек в акватории Свирской губы на протяжении всего периода миграции птиц весной и осенью 2023, 2024 годов; анализ отобранных образцов методом количественной ПЦР в реальном времени (для детекции eDNA известных массовых видов птиц) и методами высокопроизводительного секвенирования (для избирательного метабаркодирования eDNA птиц). Также будет проводиться сопутствующий визуальный учет видового состава и численности птиц на акватории проведения работ со стационарных наблюдательных пунктов, необходимый для оценки достоверности данных, полученных при анализе eDNA.
Полученные в ходе реализации проекта данные позволят определить период присутствия в воде фрагментов eDNA птиц, длина которых достаточна для проведения видовой идентификации. Параллельно будут изучены оптимальные способы забора и концентрирования eDNA птиц из образцов воды. Будут разработаны и апробированы праймеры для видоспецифичной детекции eDNA массовых видов водоплавающих птиц арктической зоны, мигрирующих через Ладожское озеро, и получены данные о представленности и концентрации в отобранных образцах (весна и осень 2023, 2024 годов) последовательностей eDNA видов-мишеней. Будет разработана панель праймеров для наиболее информативного метабаркодирования eDNA птиц. Выполнены секвенирование ДНК-библиотек, полученных из образцов eDNA, собранных в 2023 – 2024 годах, технологиями Oxford Nanopore и Illumina и последующая биоинформатическая обработка данных. Полученные результаты молекулярно-генетических исследований будут сопоставлены с результатами прямых визуальных наблюдений, а также данными многолетней статистики. Будет проведена оценка эффективности и ограничений применения различных методов анализа eDNA (ПЦР в реальном времени, высокопроизводительное секвенирование Oxford Nanopore и Illumina) для регистрации биоразнообразия и относительной численности водоплавающих птиц арктической зоны на миграционных стоянках в акватории Свирской губы. На основе полученных результатов будет разработана концепция экологического мониторинга водоплавающих птиц, опирающаяся на использование метода eDNA.
Ожидаемые результаты
1. Будет оптимизирована методика концентрирования, консервации и выделения eDNA птиц из воды, загрязненной органическими взвесями. В дальнейшем, метод может быть использован для извлечения eDNA птиц из пресных водоемов.
2. Будет изучена динамика деградации eDNA при различных параметрах водной среды (температура и pH) в Ладожском озере. В результате будет определена оптимальная, доступная для обнаружения, длина фрагментов eДНК птиц, а также временной диапазон, в течение которого данные фрагменты могут быть зарегистрированы в воде. Полученные результаты будут использованы при разработке панели праймеров для детекции eDNA птиц в воде.
3. В периоды весенней и осенней миграции птиц (2023 – 2024 годы) будет выполнен отбор проб eDNA сo стационарных точек в северо-восточной части акватории Свирской губы сопровождающийся прямым визуальным мониторингом видового состава и численности орнитофауны.
3. Будут разработаны и апробированы тест-системы для видоспецифичной детекции в воде eDNA водоплавающих птиц арктической зоны мигрирующих через акваторию Свирской губы Ладожского озера методом количественной ПЦР в реальном времени. Полученные тест-системы могут быть использованы для последующей детекции eDNA соответствующих видов птиц в арктических водоемах и на маршрутах миграции.
4. С учетом данных о динамике деградации ДНК в Ладожском озере будет разработана и апробирована универсальная панель праймеров для метабаркодирования eDNA птиц.
5. Будут выполнены эксперименты по анализу представленности и концентрации видоспецифических последовательностей ДНК водоплавающих птиц в образцах eDNA, отобранных со стационарных пунктов в акватории Свирской губы Ладожского озера на протяжении 2023-2024 годов методом количественной ПЦР в реальном времени.
6. Будут выполнены эксперименты по определению биоразнообразия и относительной численности птиц методом метабаркодирования (технологии секвенирования Oxford Nanopore и Illumina), с использованием образцов eDNA, отобранных со стационарных пунктов в акватории Свирской губы Ладожского озера на протяжении 2023-2024 годов;
5. Полученные в ходе выполнения Проекта результаты анализа eDNA птиц в водной среде будут сопоставлены между собой, а также с данными сопутствующих прямых визуальных наблюдений и данными многолетних наблюдений. Будет проведена оценка эффективности и ограничений использования различных методов анализа eDNA для детекции водоплавающих птиц и определения их относительной численности на акватории крупного пресноводного водоема. В перспективе, разработанный комплекс методических подходов может быть использован при реализации программ многолетнего экологического мониторинга орнитофауны арктической зоны России.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Для проведения запланированной работы научный коллектив оборудовал лабораторию, отвечающую повышенным требованиям к стерильности при работе с образцами ДНК из окружающей среды (eDNA) в соответствии с общепринятыми мировыми стандартами.
Определен оптимальный метод фильтрации больших объемов воды с высоким содержанием взвешенных веществ для получения концентрированных образцов эДНК. Было установлено, что для решения этой задачи подходит только использование электрических вакуумных систем фильтрации. Из-за низкой эффективности и исключительной трудоемкости ручная фильтрация оказалась малоэффективной. Оптимальный размер пор мембранных фильтров составлял 0,45 мкм. Было обнаружено, что фильтры с большими размерами пор, несмотря на увеличение пропускной способности, менее эффективны в улавливании eDNA.
Разработаны и испытаны видоспецифичные праймеры и зонды TaqMan для идентификации фрагментов D-петли митохондриальной ДНК кур, пригодные для изучения динамики деградации ДНК в воде. Основные эксперименты по динамике деградации ДНК проводились в воде Свирской губы Ладожского озера. В одном эксперименте использовали 5 стерильных литровых колб. В первые три колбы добавляли 25 мкг общей высокомолекулярной ДНК цыплят. Четвертый был заполнен такой же водой (1 литр) без куриной ДНК в качестве отрицательного контроля. В пятой колбе в качестве положительного контроля использовали 1 л дистиллированной воды с куриной ДНК. Колбы помещали на шейкерную платформу и выдерживали в темноте 14 сут при +8°С. Затем из колб отбирали по 100 мл воды для фильтрации через 4 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 8 и 14 сут. Фильтры хранили при температуре -80°С до процедуры выделения эДНК. Эксперимент по деградации ДНК проводили в начале и в конце массовой миграции птиц. Температура воды и рН были разными.
Проведено обследование акватории Свирской губы Ладоги, установлены места расположения трех точек отбора проб и двух стационарных наблюдательных постов. С середины апреля до конца мая на стационарных постах наблюдения ежедневно проводили учет видового разнообразия и численности водоплавающих птиц в местах отбора проб. 22 апреля на Ладожской орнитологической станции была развернута полевая лаборатория для фильтрации проб воды и проверки работоспособности мембранных фильтров с учетом повышенной мутности воды в местах отбора проб.
Отбор и фильтрацию воды проводили каждые семь дней с 23 апреля по 28 мая 2023 г. На каждой станции отбирали 4-литровые бутылки с озерной водой и 2-литровые бутылки с нулевой пробой (содержащие дистиллированную воду). Для фильтрации использовали 1800 мл озерной воды на участок (по 450 мл из каждой бутылки) и два литра нулевой пробы. Фильтры с иммобилизованной eDNA позже использовались для обнаружения следов арктических водоплавающих птиц с помощью количественной ПЦР в реальном времени.
Для поиска видоспецифичных участков митохондриальной ДНК 13 видов арктических водоплавающих птиц, мигрирующих через Свирскую губу Ладожского озера, были проанализированы полные митохондриальные геномы, а также отдельные последовательности генов COI, CytB, 12S рРНК и D-петли одного вида. всего 77 видов водоплавающих и куликов. Для этого мы использовали геномные последовательности, общедоступные в генетических базах данных NCBI. Оказалось, что единственным участком митохондриальной ДНК, удовлетворяющим требованиям высокого уровня видовой специфичности, является последовательность D-петли. Мы проанализировали 496 последовательностей D-петлей 41 родственного вида водоплавающих и куликов. ПЦР в реальном времени с зондами TaqMan была выбрана как наиболее чувствительный и экономичный метод обнаружения птичьей ДНК. Разработаны и испытаны высокоспецифичные тест-системы ПЦР для всех заявленных в Проекте видов: белощекой казарки, белолобого гуся, лебедя-кликуна, малого лебедя, свиязи, шилохвости, хохлатой чернети, морской чернети, синьги, турпана и чернозобой гагары.
Для того чтобы найти оптимальный участок митохондриальной ДНК, пригодный для целей метабаркодирования эДНК птиц (определения максимального количества видов до видового уровня), были проанализированы последовательности четырех генов COI, CytB, 12S и 16S рРНК у 84 водоплавающих и околоводные виды птиц, принадлежащие к 10 отрядам, зарегистрированным на территории Нижне-Свирского заповедника: Anseriformes (26 видов), Charadriiformes (35 видов), Gaviiformes (2 вида), Podicipediformes (4 вида), Gruiformes (7 видов), Pelecaniformes (3 вида), Ciconiiformes (1 вид), Accipitriformes (2 вида), Passeriformes (3 вида) и Coraciiformes (1 вид). Поиск проводили в общедоступной базе генетических данных Nucleotide (NCBI). Искомый фрагмент ДНК должен иметь длину до 200 п.н. без учета длины праймеров и быть высоковариабельным для дифференциации близкородственных видов птиц. Соответствующая последовательность была обнаружена в гене COI. Для его амплификации были разработаны и испытаны универсальные праймеры. Размер продукта ПЦР составляет 227 п.н., внутренняя область, обладающая достаточной вариабельностью для метабаркодирования, имеет размер 184 п.н.
Дополнительно были отобраны и отфильтрованы пробы воды с нескольких участков в Балтийском море (Куршский залив, 12 проб воды и 6 нулевых проб, 8-20 апреля 2023 г.; Финский залив, 7 проб воды и 7 нулевых проб, 20-21 апреля 2023 г.) и Карское море (12 проб воды и 6 нулевых проб, 31-22 июля 2022 г.). Отбор проб сопровождался визуальной регистрацией видового состава и численности птиц в местах отбора проб. Эти образцы eDNA вместе с образцами из Ладожского озера будут использованы для изучения возможностей и ограничений определения биоразнообразия птиц методом метабаркодирования eDNA из водной среды с использованием технологий высокопроизводительного секвенирования Oxford Nanopore и Illumina.
Публикации