КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 22-74-10042

НазваниеРоль агрегации и коагрегации белков в развитии патологий нервной системы

РуководительБондарев Станислав Александрович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный университет", г Санкт-Петербург

Период выполнения при поддержке РНФ 07.2022 - 06.2025 

Конкурс№71 - Конкурс 2022 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые словаамилоиды, кросс-сидинг, амилоидозы, микробиом, альфа-синуклеин, коагрегация

Код ГРНТИ34.15.15

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Амилоиды – это особая группа белковых агрегатов с рядом необычных свойств, среди которых - высокая устойчивость к действию детергентов и протеаз, а также способность индуцировать переход некоторых белков из растворимой формы в агрегированную. Многочисленные исследования амилоидов сегодня особенно актуальны в связи с увеличивающейся частотой заболеваний, которые они вызывают, например, болезни Альцгеймера, Паркинсона, Хантингтона, диабет второго типа и т.д. Открытие амилоидогенных белков, способных коагрегировать друг с другом, продемонстрировало наличие нового и пока неизученного вида межмолекулярных взаимодействий. В последнее время становится всё более очевидным, что такие взаимосвязи могут играть важную роль в патогенезе амилоидных заболеваний у человека и животных. Сейчас известен ряд примеров коагрегации белков, связанных с различными амилоидозами человека, в частности, показана коагрегация следующих белков: амилоид-бета и альфа-синуклеин (aSyn), амилоид-бета и амилин, амилоид-бета и PrP. Не так давно этот список пополнился примерами коагрегации белков разных видов, в частности aSyn и CsgA Escherichia coli, aSyn и PSMαs Staphylococcus aureus, aSyn и N белок SARS-CoV-2, амилоид-beta и FapCS Pseudomonas aeruginosa. Вероятно, этот список далеко не полон. В рамках представленного проекта мы проведём первый в своём роде масштабный поиск новых примеров коагрегации aSyn и амилоидных белков бактерий с помощью мультидисциплинарных подходов. В том числе мы предложим новую уникальную экспресс методику для проверки способности амилоидных фибрилл экспонированных на поверхности клеток E. coli запускать агрегацию рекомбинантных белков. Достоинство этой методики заключается в том, что она может быть в дальнейшем легко перенесена на живые объекты. Исследуемые штаммы бактерий могут быть использованы для заражения лабораторных животных с целью мониторинга развития у них амилоидозов. Ключевым результатом этой части будет список видов бактерий, белки которых могут ускорять агрегацию aSyn и, как следствие, вызывать развитие синуклеинопатий. Исследование молекулярных механизмов коагрегации белков в составе амилоидов, в частности вклада ионных взаимодействий, является другой важной задачей проекта. В результате её решения мы сможем обоснованно предлагать ингибиторы для коагрегации различных белков. Поскольку первая часть проекта направлена на поиск бактериальных белков, вызывающих агрегацию aSyn мы планируем предложить специфические ингибиторы для выявленных взаимодействий. Немаловажным и уникальным результатом может стать получение амилоидных фибрилл из пептидов с разными зарядами, а также проверка возможности контроля их сборки. По результатам проекта будет описана роль сверхпродукции и агрегации NOS1AP в гибели нервных клеток, а также развитии симптомов шизофрении у лабораторных животных. Возможность агрегации этого белка впервые была показана в нашей лаборатории. Интерес к его дальнейшему исследованию обоснован тем, что ген NOS1AP ассоциирован с развитием шизофрении, а белок вовлечён в различные процессы, связанные с гибелью нервных клеток. Последнее обстоятельство наталкивает на гипотезу о возможных токсических эффектах агрегации NOS1AP. Важно отметить, что данные об экспрессии этого гена и продукции белка в животных моделях шизофрении отсутствуют. Мы рассчитываем заполнить этот пробел, а также описать интерактом NOS1AP в масштабе всего протеома.

Ожидаемые результаты
Одним из ключевых результатов проекта станет идентификация бактериальных амилоидогенных белков, способных ускорять агрегацию альфа-синуклеина (aSyn). Уникальность представленного проекта также заключается в использовании специализированной программы для поиска белков, способных к коагрегации. Мы планируем проанализировать не менее 500 протеомов для поиска подобных белков. Исследования подобного масштаба ранее не проводились. Для экспериментальной проверки результатов биоинформатического анализа будет разработан не имеющий аналогов в мире экспресс метод для проверки полученных результатов in vitro. Он основан на использовании препаратов рекомбинантных белков, а также клеток E. coli с экспонированными на поверхности амилоидными фибриллами тестируемого белка. Важным достоинством созданной системы является потенциальная возможность её использования in vivo в экспериментах по заражению этими же бактериями лабораторных животных. На основании списка бактериальных амилоидов, ускоряющих агрегацию aSyn, будет составлен список видов бактерий, которые могут вызывать развитие синуклеинопатий. Эти заболевания относятся к социально-значимым, что показывает ценность полученных результатов для общества и медицины. В частности, наши данные могут быть в дальнейшем использованы в медицине для оценки риска развития этих заболеваний у конкретных пациентов. С их помощью также станет возможным рациональный подбор антимикробных препаратов для контроля микрофлоры с целью снижения вероятности развития синуклеинопатий, вызванных дисбалансом бактерий или инфекцией. В рамках проекта будет создана новая система для продукции коротких пептидов в клетках бактерий, которая в дальнейшем может быть использована в различных исследованиях и биотехнологии. Мы рассчитываем, что уникальным результатом проекта станет проверка возможности получения искусственных амилоидных гетерофибрилл на основе пептидов с разными зарядами. Полученные данные внесут вклад в фундаментальное понимание роли ионных взаимодействий в процесс коагрегации белков. Это в свою очередь позволит предложить пептидные ингибиторы коагрегации бактериальных амилоидов и aSyn. Ранее в нашей лаборатории были получены доказательства агрегации белка NOS1AP в культуре клеток человека. Интерес к дальнейшему изучению патологической роли этого процесса во многом связан с тем, что ген NOS1AP ассоциирован с развитием шизофрении у человека, а продукт этого гена принимает участие в процессах, приводящих к гибели нейронов. В рамках проекта впервые будет проанализирована роль агрегации NOS1AP в гибели нервных клеток и развитии симптомов шизофрении на модельных объектах. Также будет описан полный интерактом этого белка в мономерной и агрегированной форме. Важным результатом станет описание изменения экспрессии этого гена в культуре клеток нейробластомы, а также в модели шизофрении на животных. На данный момент в литературе эти данные отсутствуют. При этом они имеют значение в свете сложной этиологии шизофрении, либо животных моделей этого заболевания. Полученные нами результаты позволят лучше понять молекулярные механизмы, лежащие в основе этой патологии.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Амилоиды – это особая группа белковых агрегатов с кросс-β-структурой и рядом необычных свойств, среди которых - высокая устойчивость к действию детергентов и протеаз, а также способность индуцировать переход некоторых белков из растворимой формы в агрегированную. Открытие амилоидогенных белков, способных коагрегировать друг с другом, продемонстрировало наличие нового, и пока неизученного, вида межмолекулярных взаимодействий. Сейчас известны многочисленные примеры коагрегации белков, связанных с различными амилоидозами, в частности, показана коагрегация следующих белков: амилоида-β и α-синуклеина (aSyn), амилоида-β и амилина, амилоида-бета и PrP. Не так давно этот список пополнился примерами коагрегации белков разных видов, в частности aSyn человека и CsgA Escherichia coli, aSyn и PSMαs Staphylococcus aureus, aSyn и N-белка SARS-CoV-2, амилоида-β и FapCS Pseudomonas aeruginosa. В рамках проекта мы провели первый в своём роде масштабный биоинформатический поиск новых примеров коагрегации aSyn человека и амилоидогенных белков бактерий. При этом мы обнаружили, что среди выявленных кандидатов достоверно повышена частота встречаемости белков, входящих в состав поверхностных структур. Это косвенно свидетельствует в пользу гипотезы о том, что амилоидные агрегаты бактериальных белков могут влиять на агрегацию aSyn, поскольку именно поверхностные белки бактерий в первую очередь могут контактировать с белками человека. Для последующей экспериментальной проверки результатов была отработана методика индукции агрегации рекомбинантных белков в присутствии клеток бактерий E.coli с амилоидными фибриллами на своей поверхности. Второе направление проекта связано с описанием биологической значимости сверхпродукции и агрегации NOS1AP, а также развитии симптомов шизофрении. За отчетный период мы создали искусственную аллель NOS1AP (mNOS1AP), которая значительно снижает способность белка к агрегации в различных экспериментальных системах. С ее помощью мы получили важные данные о нарушении взаимодействия mNOS1AP и aSyn. Этот факт совпадает с нашим предположением о том, что NOS1AP неспецифически коагрегирует с aSyn. Поскольку агрегация mNOS1AP нарушена, мы не наблюдаем взаимодействия между этими белками. Также мы продемонстрировали, что сверхпродукция NOS1AP, или его фрагментов, не оказывает влияния на жизнеспособность клеток. Это позволяет заключить, что сами по себе агрегаты NOS1AP не являются токсичными для клеток. При исследовании возможности агрегации нативного NOS1AP мы продемонстрировали, что обработка клеток нейробластомы NMDA увеличивает продукцию этого белка, однако не приводит к его агрегации. Мы успешно отработали методику ко-иммунопреципитации NOS1AP, а также начали первый эксперимент по идентификации взаимодействующих с ним белков. За отчетный период собраны все образцы крыс, подвергнутых инъекциям дизоцилпина (MK-801) для моделирования симптомов шизофрении, а также контрольной группы. Наконец, мы впервые провели детальный анализ изменения поведения таких животных в тесте “открытое поле”. Также была начата проверка экспрессии NOS1AP и продукции соответствующего белка у этих животных. По предварительным данным эта модель не позволяет воспроизводить сверхпродукцию NOS1AP, описанную у пациентов с шизофренией.

 

Публикации