Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Структурные белки SMC-комплексов, к которым относят когезин, конденсины-I/II и SMC5-6, не только формируют топологическую структуру хромосом, но и участвуют в репарации двухцепочечных разрывов ДНК (DSB). В частности, было показано, что нокаут по когезину приводит к увеличению частоты геномных делеций при внесении двух DSB на расстоянии 3 тыс. п.о., но не влияет на частоту маленьких делеций (~30 п.о.). Это объясняется тем, что молекулы когезина топологически ограничивают подвижность концов разрыва. Основная задача нашего проекта - использовать метод капельной цифровой ПЦР (ddPCR) для детекции больших и маленьких делеций в геноме и определить влияние ауксин-индуцибельной деградации Rad21 (когезин) и Smc2 (конденсины I+II) на частоты перестроек в различных локусах. Мы проанализировали данные Hi-C и ChIP-seq для хромосомы 6 в ЭС клетках мыши и выбрали по 2 района для каждого из 5 типов участков: обычные районы внутри топологических доменов (ТАДов); районы с сильной границей между ТАДами; маленькие ТАДы; районы с активным и неактивным хроматином). На каждый из районов были подобраны и заклонированы gРНК (10х4). gРНК были синтезированы in vitro с помощью T7-полимеразы. Мы успешно проверили два варианта тестирования активности гайдов: ПЦР-амплификация делеций (метод чувствителен даже для частот делеций ~3%) и TIDE (оценка числа мутантных аллелей в популяции клеток по секвенограмме). Были созданы 3 gРНК на тестовый район Ace2 на Х-хромосоме (делеции размером 192 и 3495 п.о). Мы использовали этот район для отработки условий нуклеофекций на приборе Neon. Для электропорации клеток мы выбрали условие #6 (Neon). Мы обратили внимание на довольно большой разброс в биологических репликах (разные электропорации), поэтому будем использовать три биологических реплики в дальнейшем. Мы оценили тайминги возникновения делеций (3, 10, 24 часа после нуклеофекции) и решили остановиться на сборе клеток через 24 часа после нуклеофекции, с добавлением ауксина за час до нуклеофекции и в течение последующих 24 часов. Мы проверили частоты перестроек в разных ЭС клонах и решили отказаться от использования Rad21 клонов с делецией MCPH1, которые не показывают больших отличий от исходного клона Rad21. Мы отработали протокол анализа перестроек на ЭС клетках мыши методом ddPCR. В целом, метод показал высокую эффективность и чувствительность для детекции делеций и инверсий. Для большинства проанализированных клонов частоты делеций находились в диапазоне 6-20%, а частоты инверсий – 2-10%. Было показано, что добавление ауксина перед нуклеофекцией не влияет на выживаемость клеток. Мы попытались проверить гипотезу о том, что нокдаун когезина приводит к росту числа больших делеций. В нашем случае, мы не смогли утверждать это однозначно, необходимо проведение дополнительных экспериментов. Однозначно показано, что добавление ауксина к ЭС клону Smc2 вызывает рост числа инверсий на 10-100% для локуса mACE2. Повышение частоты инверсий наблюдалось для всех проанализированных биологических реплик Smc2 на разных условиях. При этом, мы не обнаружили такого эффекта в ЭС клонах CapH2 (конденсин-II) и Rad21 (когезин). Таким образом, мы можем констатировать, что эффект от двойной деплеции конденсинов есть, но его механизм еще предстоит установить. Наши эксперименты также показали, что необходимо внимательно проверять партии белка NLS-Cas9 (Biolabmix), так как их активность отличается в несколько раз. Мы учтем это фактор для масштабного эксперимента.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Целью нашего Проекта было определить, как структурные белки SMC-комплексов (когезин и конденсины) участвуют в репарации отдаленных двухцепочечных разрывов ДНК (DSB). В некоторых исследованиях утверждается, что нокдаун когезина приводит к увеличению частоты геномных делеций из-за того, что молекулы когезина топологически ограничивают подвижность концов разрыва во время когезии сестринских хроматид. В заключительный год выполнения Проекта мы воспользовались методом ddXR+IAA для оценки частот делеций и инверсий в разных геномных контекстах на фоне ауксиновой деплеции Rad21 (когезин) или Smc2 (конденсины I/II). Мы определили токсичность метода в совокупности с добавлением ауксина/внесением разрыва, подсчитав выживаемость ЭС клеток после нуклеофекции или добавления ауксина, а также при добавлении ауксина после нуклеофекции. Мы получили уникальную информацию о выживаемости мышиных эмбриональных стволовых клеток (мЭСК) в методе ddXR. По нашим данным, основной вклад в смертность клеток вносит деплеция SMC-белков, но отсутствие SMC-белков не увеличивает дополнительно смертность от DSB. Мы также применили метод serum starvation для синхронизации мЭСК в G1/S-фазе, однако их состояние не позволяет выживать после нуклеофекции. В дальнейшем, наш протокол можно будет легко адаптировать для оценки структурных перестроек в любых районах генома и на различных типах клеток. Используя ddXR-IAA, мы проанализировали эффект деплеций Rad21 на большом числе районов, уделив особое внимание двум участкам (Ace2 F-R2 3495 п.о. и Ctcf1 F-R2 3930 п.о.). Деплеция Rad21 не увеличивает частоты делеций в наших условиях, для района Ace2 даже наблюдалось 12% снижение. Деплеция Smc2 явно увеличивает частоту как делеций, так и инверсий, однако из-за высокой биологической вариабельности мы пока не смогли подкрепить это статистически. Мы планируем провести больше экспериментов на описанных здесь делециях. Для создания делеций в различных районах генома мы синтезировали более 40 gРНК. С их помощью мы создали множество делеций с частотой от 1% до 15%. Важно, что для большинства районов, даже для границ между топологически-ассоциированными доменами (ТАДами), в формировании которых важную роль играет когезин, мы не увидели значимой разницы при деплеции когезина. Единственный интересный район (маленький ТАД 2) - показал значительные изменения при деплеции когезина (-15% для района 4699 п.о., но +28% для района 150591 п.о.) и конденсинов (+49% для района 150591 п.о.). Мы изучим его более подробно в будущем. Результаты гранта были представлены на двух конференциях и в одной статье. Мы также подготовили обзор на тему генетических репортеров для изучения репарации DSВ, который может быть полезен ученым-экспериментаторам.