КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 22-74-00069

НазваниеВлияние социально значимых факторов внешней среды на функции сердечно-сосудистой системы здоровых лиц по данным протеомного анализа крови

РуководительКаширина Дарья Николаевна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации - Институт медико-биологических проблем Российской академии наук, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

07.2022 - 06.2024

Конкурс№70 - Конкурс 2022 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые словаХромато-масс-спектрометрия, протеом, плазма крови, сухие пятна крови, сердечно-сосудистая система, сухая иммерсия, антиортостатическая гипокинезия, здоровые добровольцы

Код ГРНТИ76.29.30

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Современному образу жизни в высокоразвитых странах сопутствует гиподинамия, которую называют болезнью 21 века. Гиподинамия представляет собой снижение мышечной деятельности, которое обуславливается сидячим образом жизни, ограничением двигательной активности и снижением силы сокращения мышц. Значимость гиподинамии как социально-значимой проблемы для здравоохранения постоянно растёт, поскольку недостаточная двигательная активность входит в патогенез многих распространённых недугов, в результате которых происходит ранняя потеря трудоспособности. Малоподвижный образ жизни провоцирует развитие сердечно-сосудистых заболеваний, изменения опорно-двигательного аппарата, нарушения обмена веществ, расстройства деятельности нервной системы, ожирение, диабет, рак. Одной из самых чувствительных систем организма к ограничению уровня двигательной активности является сердечно-сосудистая система, негативные изменения в которой приводят к атеросклерозу, артериальной гипертонии, ишемической болезни сердца и другим заболеваниям, повышающим риск ранней инвалидизации работоспособного населения. На молекулярном уровне сидячий образ жизни приводит к повышению продукции активных форм кислорода, способных, в свою очередь, модифицировать белки. Окислительная (оксидативная) модификация белков – один из индикаторов поражения тканей при различных патологических состояниях. Помимо деструкции белков, окисление может приводить к нарушению клеточно-матриксного взаимодействия, влиять на адгезивную функцию белков. Известно, что повышение активных форм кислорода способствует развитию эндотелиальной дисфункции и атеросклерозу. Противодействие последствиям привычной гиподинамии имеет значимую социальную составляющую, т.к. заболевания, вызванные гиподинамией, увеличивают нагрузку на бюджет государства. В настоящее время активно развиваются методы борьбы с заболеваниями, вызванными гиподинамией, в т.ч. – профилактической направленности, среди которых пропаганда здорового образа жизни, спорта и поддержания адекватного уровня физической активности. Однако несмотря на то, что польза поддержания физической формы бесспорна, уровень гиподинамии в большинстве стран остаётся угрожающим. Гиподинамия, по данным доклада ВОЗ, занимает 4-е место в ряду причин глобальной смертности после гипертонии, курения и гипергликемии – на её долю приходится около 10% случаев преждевременных смертей в год во всем мире. Пандемия новой коронавирусной инфекции изменила уклад жизни всех людей на планете, усугубив проблему медико-социальных последствий гиподинамии. Общепризнанными моделями для изучения эффектов гиподинамии на организм здорового человека в контролируемых условиях являются эксперименты с антиортостатической гипокинезией (постельный режим с небольшим углом наклона головного конца кровати) и с «сухой» иммерсией. Сухая иммерсия, помимо эффекта безопорности и равномерной компрессии, создает эффект острой гиподинамии и гипокинезии. В дополнение к быстрому ограничению нормальной мышечной активности и снижению напряжения в мышцах и суставах , термонейтральное погружение тела человека в ванну непосредственно и сразу вызывает значительное снижение мышечного тонуса, что не достигается даже при длительном постельном режиме. Т.е. эксперимент с «сухой» иммерсией позволяет получать изменения, вызванные гиподинамией, за более короткий промежуток времени. Предшествующее исследование действия гиподинамии на организм человека в эксперименте с сухой иммерсией показало, что условия эксперимента вызывают микрососудистые нарушения, дисфункцию эндотелия с повышением циркулирующих эндотелиальных микрочастиц. Микроциркуляторная эндотелиальная дисфункция может способствовать нарушению функций сердечно-сосудистой системы, а также другим патологиям, связанным с гиподинамией. Поэтому эндотелий должен находиться в центре особого внимания в ситуациях острого ограничения физической активности. В последнее время исследования белкового состава крови здорового человека, методами протеомики на основе масс-спектрометрии, широко применяются для анализа биологических процессов, происходящих на молекулярном уровне в организме. Этот фенотипичекий уровень регуляции генной экспрессии под воздействием внешних факторов может стать ключом к расшифровке механизмов, приводящих к эффектам, вызванным гиподинамией, и, в конечном счете, к поиску эффективных контрмер для предотвращения дисфункций и заболеваний. Анализ посттрансляционных окислительных модификаций, значительно изменяющих функции белков, позволит выявить пути нарушения функционирования сосудов. Поскольку известно, что процесс приспособления молекулярных функций к изменяющимся для организма условиям среды реализуется, в том числе, через процессы пост-трансляционной модификации синтезирующихся белков. Исследование протеомных изменений при ортопробе, проводимой после длительного нахождения в положении антиортостатической гипокинезии, позволит выявить молекулярные паттерны, включающиеся при резкой нагрузке на сердечно-сосудистую систему, ослабленную длительной гипокинезией. Информация по изменению протеомного состава крови в наших экспериментах может помочь в выборе и обосновании панели белков, являющихся ранними предикторами сердечно-сосудистых заболеваний. Разработанная панель белков может стать основой для мониторинга состояния сердечно-сосудистой системы как в норме, так и в группах риска по развитию заболеваний ССС. Хотя в настоящее время уже предложены некоторые белки, являющиеся биомаркерами сердечных заболеваний, однако эти маркеры были верифицированы на пациентах, уже имеющих клинические проявления болезни. Поэтому областью их практического использования является мониторинг течения заболевания, эффективности лечения и прогноза. Очевидно, что важно выявление ранних предикторов, которые укажут на вероятность возникновения патологических процессов, еще не проявивших себя клинически на момент анализа, и которые возможно будет купировать или замедлить. Отметим, что в литературных источниках имеется много результатов исследований малоподвижного образа жизни, однако данные работы имеют существенные недостатки в виде неконтролируемых условий в которых проведено исследование, сопутствующих заболеваний у групп обследуемых, субъективной оценки двигательной активности, применения препаратов, влияющих на исследуемые параметры. В данном проекте планируется исследование крови и функций ССС здоровых добровольцев, отобранных специальной врачебной экспертной комиссией, не имеющих хронических заболеваний, с нормальным ИМТ, которые находятся в экспериментальных условиях под полным контролем условий жизнедеятельности. Еще одним преимуществом данной работы является использование в качестве источника белков крови – высушенных пятен крови, которые могли бы стать основой для мониторинга ввиду их минимальной инвазивности (получение образца проколом пальца) и легкого получения проб неспециалистами. На основании этого целями проекта явилось исследование, методами протеомики на основе хромато-масспектрометрии, белков сердечно-сосудистой системы и их окислительных модификаций в крови здоровых людей при гиподинамии, моделируемой в экспериментах с 21-суточной антиортостатической гипокинезией и с «сухой» иммерсией продолжительностью 7 суток.

Ожидаемые результаты
Путем выявления концентрации различных белков в плазме и сухих пятнах крови здоровых добровольцев, участвующих в эксперименте с 21-суточной антиортостатической гипокинезией, а также с 7 суточной иммерсией, будут определены белки, осуществляющие свои функции в сердечно-сосудистой системе и проанализирована динамика изменений их концентраций при действии моделируемой гиподинамии. Будут определены белки, подвергшиеся посттрансляционной окислительной модификации. На основании выявленных данных с помощью открытых биоинформационных ресурсов будут предложены гипотезы о молекулярных механизмах изменений сердечно-сосудистой системы. Также планируется проведение сравнительного анализа изменений ССС в экспериментах. Таким образом, полученные результаты укажут на белки и ферменты, участвующие в потенциальных атеросклеротических процессах у людей, ведущих малоподвижный образ жизни. Обнаружение белков с повышенными оксидативными посттрансляционными модификациями, что выраженным образом влияет на их функциональные свойства, позволит детектировать возможные пути нарушений функций сосудов. Выявление потенциальных белков-биомаркеров для характеристики генеза ранней стадии дисфункции сердечно-сосудистой системы, развивающейся в условиях гиподинамии, и их молекулярных связей дадут возможность предложить методы мониторинга здоровья людей, а также медикаментозные методы профилактики негативных последствий. Комплекс этих мер имеет значимое социальное значение, снижая бюджетную нагрузку для лечения и реабилитации пациентов с поражениями сердечно-сосудистой системы. Предусматриваются публикации 4 научных статей, посвященных полученным результатам, а также участие в международных конференциях, таких как BGRS, «Белки и пептиды».

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В ходе выполнения работ по проекту проведен хромато-масс-спектрометрический анализ образцов плазмы и экстрактов сухих пятен, собранных у 6 здоровых добровольцев, принимавших участие в эксперименте с 21-суточной антиортостатической гипокинезией (АНОГ). Взятие венозной крови осуществлялось натощак за 6 суток до начала эксперимента, на 2, 6, 13 и 21 сутки АНОГ и на 1 и 7 сутки периода восстановления, капиллярную кровь отбирали за 5 суток до эксперимента, на 2, 7, 13, 20 сутки гипокинезии и на 1 и 7 сутки после ее окончания. Также на 19 сутки АНОГ был проведен тест с пассивной пробой на ортостатическую устойчивость. Образцы пятен крови отбирали до ортопробы и сразу после ее окончания (интервал времени между взятиями крови составил 3-4 часа). В процессе подготовки образцов к масс-спектрометрическому анализу образцы плазмы очищали от мажорных белков с помощью колонок Top 12, сухие пятна крови подвергали экстракции с бумажных фильтров, затем образцы и плазмы, и пятен, проходили стандартную пробоподготовку, включающую этапы восстановления, алкилирования, осаждения и трипсинолиза. Предварительно пептидные смеси, подвергались выравниванию по концентрации общего белка. Полученные смеси триптических пептидов анализировали методом жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии на основе системы нано-ВЭЖХ Dionex Ultimate3000 (Thermo Fisher Scientific, США) и масс-спектрометра TimsTOF Pro (Bruker Daltonics, США). Масс-спектрометрический анализ проводили с использованием метода параллельного накопления при последовательной фрагментации (PASEF). Полученные данные LC-MS/MS были проанализированы с помощью PEAKS Studio 8.5. Для полуколичественных анализов использовался метод "label-free". Также MS спектры анализировались для выявления изменений масс пептидов, соответствующих определенным окислительным модификациям. Статистический анализ проводился в программе Statistica 12 c помощью непараметрического теста Манна-Уитни (p-value < 0,05). Молекулярные функции и биологические процессы, обогащенные выявленными белками, были определены с помощью веб-ресурсов DAVID (https://david.ncifcrf.gov) и STRING (https://string-db.org), а информация о белках была получена из базы данных UniProt (https://www.uniprot.org). Поиск связей с процессами, ассоциированными с сердечно-сосудистой системой, осуществляли с помощью программы ANDSystem. Оценку уровня целевого маркера ST2 в образцах плазмы добровольцев проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Дополнительно были проанализированы динамика кардиомаркера NT-proBNP, свидительствующего о перегрузке сердца объемом, а также динамика маркера тромбообразования D-димера. Измерение концентрации NT-proBNP и D-димера проводили иммунофлуоресцентным методом. Статистический анализ данных по уровню маркеров проводили в программе Statistica 12 с использованием дисперсионного анализа Friedman ANOVA (p-value< 0.05). Для сравнения полученных результатов протеомного анализа с показателями состояния сердечно-сосудистой системы, использовали анализ данных ЭКГ и тахоосцилограммы. С помощью метода главных компонент участники были разделены на однородные группы. Проведен поиск белков, вносящих вклад в различия между группами. Было выявлено, что условия АНОГ приводят к увеличению уровня белков систем комплемента и коагуляционного каскада, дегрануляции тромбоцитов, фибринолиза, белков острой фазы, посттрансляционной модификации белков, ретинол-связывающего белка 4 (RBP4), аполипопротеина В, ассоциированных с ССЗ, и других белков, оказывающих влияние на функции эндотелиальных клеток, при этом снижается уровень белков, участвующих в биосинтезе аминокислот, гликолизе, транспорте кислорода, катаболизме гема и др. в крови участников эксперимента. Также в образцах сухих пятен выявлено увеличение протеиназы 3 (PRTN3), расщепляющей белки внеклеточного матрикса и способствующей повреждению эндотелиального монослоя, которое нарастало с каждой неделей АНОГ, достигая максимума к концу АНОГ. Белки сывороточного амилоида 1 и 2 (SAA1, SAA2), ассоциированные с воспалением сосудов и атеросклерозом, повышались на первые сутки после выхода из АНОГ, указывая на активизацию стресс-реакций организма в ответ на пассивное вертикальное положение тела после 19-сут разгрузки сосудов. Динамика уровней ST2, NT-proBNP указывала на то, что на протяжении 21 суточной АНОГ миокардиальный стресс не инициировался. Напротив, снижение уровня ST2 на 2 сутки эксперимента относительно фона свидетельствовало о снижении нагрузки на миокард и уменьшении растяжимости миокардиоцитов. Увеличение NT-proBNP после окончания эксперимента отражало увеличение объема циркулирующей крови и роль гравитационной составляющей в увеличении функциональной нагрузки на миокард, на фоне его предшествующей адаптации к условиям АНОГ-6° в течение 21 суток. Неизмененные показатели Д-димера в крови в течение 21 сут АНОГ свидетельствовали об отсутствии риска тромбозов в условиях данного исследования. Функциональная проба с ортостатической нагрузкой после 19 суток АНОГ сопряжена с эффектами, выявляемыми на уровне протеома крови, и характеризующимися снижением уровня липопротеинов высокой плотности и белка свертывания кининогена 1. При этом после ортопробы выявлено увеличение уровней виментина, обеспечивающего устойчивость клеток к механическому стрессу, витамин К-зависимого протеина С, снижающего свертываемость крови, белков сигнального пути WNT, аутофагии, адаптивного иммунного ответа, белков фокальной адгезии, маркера повреждения сосудов S100A8, регулятора PEDF и непосредственно белков сердца: сердечного актина АСТС1 и транскрипционного фактора GATA4. По-видимому, сердце и сосуды во время АНОГ адаптируются к сниженному уровню нагрузки и ортопроба в этих условиях становится стрессирующим фактором, вызывая повышение «утечки» из сердца отдельных белков или включая ответ, связанный с повышением экспрессии кардиозащитных протеинов (ACTC1, GATA4, PEDF). Рассматривая окислительные модификации белков, отмечено, что наибольшее количество модификаций приходилось на аминокислоты: метионин, гистидин-триптофан, а также лизин, пролин, триптофан в структуре белка. Оказалось, что рост уровня окислительной модификации белков во время АНОГ характерен для 17 из 88 протеинов анализируемой выборки с выявленными окислительными модификациями. Еще у 16 белков окислительные модификации выявлялись вновь только во время эксперимента, не обнаруживаясь в фоновом периоде. Для отмеченных белков по данным веб-ресурса String характерны функции детоксификации клеточных окислителей (субъединицы гемоглобина альфа-2 и бета, каталаза, пероксиредоксин-2, гаптоглобин), метаболизма холестерола (аполипопротеины A2, B-100, C2), коагуляции крови (альфа и гамма цепи фибриногена, альфа-2-макроглобулин, альфа-1-антитрипсин), транспорта (серотрансферрин, альфа-1-кислый гликопротеин 1, альфа-2-HS-гликопротеин), структурных компонентов цитоскелета (альфа и бета цепи спектрина, анкирин-1, цитоплазматические актины 1 и 2), компонента комплемента С3 и др. Следовательно, функции данных белков были изменены, вплоть до полной утраты. Повышение окислительных модификаций белков во время АНОГ, по-видимому, является следствием некомпенсированного увеличения уровня продукции АФК в условиях 21-суточной гипокинезии, что, наряду с другими факторами, может привести к развитию патологии в сердечно-сосудистой системе. Таким образом, 21 суток гипокинезии оказалось недостаточно, чтобы развился эффект повышенного тромбообразования или миокардиального стресса, выявляемых с помощью приборов или известных маркеров, тем не менее, длительная гипокинезия способствовала повышению уровня белков, оказывающих влияние на функции эндотелиальных клеток (APOB, RBP4, C3, PRTN3, SAA1, SAA2 и др.), а также увеличению количества посттрансляционных окислительных модификаций, свидетельствующих об увеличении уровня окислительного стресса в условиях 21-суточной антиортостатической гипокинезии.

Публикации

1. Каширина Д.Н., Пастушкова Л.Х., Бржозовский А.Г., Кононихин А.С., Николаев Е.Н., Ларина И.М. ЭФФЕКТЫ 3-СУТОЧНОГО ИММЕРСИОННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ПРОТЕОМ КРОВИ ЖЕНЩИН ДОБРОВОЛЬЦЕВ Авиакосмическая и экологическая медицина, Т. 57, № 2, С. 47-56 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.21687/0233-528X-2023-57-2-47-56

2. Пастушкова Л.Х., Гончарова А.Г., Каширина Д.Н., Гончаров И.Н., Ларина И.М. ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ 21 –СУТОЧНОЙ АНТИОРТОСТАТИЧЕСКОЙ ГИПОКИНЕЗИИ НА УРОВЕНЬ БИОМАРКЕРА «РАСТЯЖЕНИЯ» МИОКАРДА ST2 В КРОВИ Физиология человека, - (год публикации - 2023)

3. Д.Н. Каширина, Л.Х. Пастушкова, А.Г. Гончарова, И.М. Ларина ИЗМЕНЕНИЯ ПРОТЕОМНОГО ПРОФИЛЯ КРОВИ ДОБРОВОЛЬЦЕВ ПРИ ДЕЙСТВИИ ФАКТОРОВ 21-СУТОЧНОЙ АНТИОРТОСТАТИЧЕСКОЙ ГИПОКИНЕЗИИ XLVII АКАДЕМИЧЕСКИЕ ЧТЕНИЯ ПО КОСМОНАВТИКЕ, ПОСВЯЩЕННЫЕ ПАМЯТИ АКАДЕМИКА С.П. КОРОЛЁВА И ДРУГИХ ВЫДАЮЩИХСЯ ОТЕЧЕСТВЕННЫХ УЧЕНЫХ — ПИОНЕРОВ ОСВОЕНИЯ КОСМИЧЕСКОГО ПРОСТРАНСТВА. КОРОЛЁВСКИЕ ЧТЕНИЯ 2023, Королёвские чтения. 2023. Т.4. С. (год публикации - 2023)

4. Пастушкова Л.Х., Гончарова А.Г., Каширина Д.Н., Ларина И.М. Changes in the body fluids proteome as a reflection of the physiological effects of dry immersion Frontiers in Physiology, V. 14. P. 1178077. (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3389/fphys.2023.1178077