КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 22-74-00025

НазваниеИсследование механизмов ингибирования митохондриальной неспецифической Са2+-зависимой поры (mРТР) с помощью NAD(Н) и его биосинтетических предшественников со стороны цитозоля

РуководительХаречкина Екатерина Сергеевна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук, Московская обл

Период выполнения при поддержке РНФ 07.2022 - 06.2024 

Конкурс№70 - Конкурс 2022 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-205 - Клеточная биология, цитология, гистология

Ключевые словаБиомедицина, биоэнергетика, митохондриология, mРТР, пиридиновые нуклеотиды, NAD(H), адениновые нуклеотиды

Код ГРНТИ31.27.39

СтатусЗакрыт досрочно

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Митохондриальная дисфункция сопровождает появление и развитие многих заболеваний, включая нарушения обмена веществ, протозойные инфекции, нейродегенеративные, нейромышечные болезни, диабет и ишемия с последующей реперфузией. Среди них ишемическая болезнь сердца и инсульт являются главными причинами смертности, инвалидности и утраты трудоспособности в современном обществе. Поэтому, разработка новых препаратов для цитопротекции сердца и мозга и способов коррекции постишемических повреждений органов, несомненно, является актуальной проблемой современной биомедицины. Ишемия, за которой следует реперфузия, индуцирует открывание во внутренней мембране митохондрий неспецифической Са2+-зависимой поры (mPTP). Данное явление приводит к повреждению внешней митохондриальной мембраны, увеличению ее проницаемости для апоптогенных факторов митохондрий, запуску клеточной гибели и повреждению органа. Согласно современным представлениям, открывание mPTP - ключевой фактор развития постишемической дисфункции. Cоответственно, mPTP является перспективной митохондриальной мишенью для предотвращения постишемических повреждений органов. К настоящему времени определены основные характеристики функционирования mPTP in vitro и in situ, идентифицированы некоторые её эндогенные и фармакологические модуляторы. Тем не менее, клинические испытания не подтвердили эффективность данных ингибиторов для облегчения последствий ишемии-реперфузии. Отсутствие обнадеживающих результатов указывает на то, что механизмы регуляции mPTP недостаточно изучены, не определены ее ключевые элементы. Кроме того, в последние годы получили развитие представления, согласно которым, клеточная гибель и необратимые повреждения органов при ишемии-реперфузии являются, в значительной мере, результатом биоэнергетического коллапса, вызванного повышенной деградацией NAD(H) и нарушением баланса NAD+/NADH в результате mPTP-индуцируемой активации NAD+-утилизирующих белков. Соответственно, активно изучается эффективность предшественников NAD(H) и ингибиторов PARP/SIRT в ослаблении тяжести последствий ишемии. И хотя данные, полученные с использованием животных моделей ишемии-реперфузии, выглядят весьма обнадеживающими, клинические испытания не подтвердили эффективность данной стратегии, что указывает на недостаточно четкое понимание механизмов действия NAD(H) и его предшественников. В то же время, наши собственные недавние исследования показали, что цитозольные NAD+ и NADH являются сильными эндогенными ингибиторами mPTP в дифференцированных клетках (Kharechkina E., 2019, 2021), что подразумевает совершенно другие механизмы активации постишемической клеточной гибели. Предлагаемый проект посвящен изучению нового направления в области регуляции mPTP: исследованию механизмов ингибирования mPTP пиридиновыми нуклеотидами (NADH и NAD+), а также их биосинтетическими предшественниками, со стороны цитозоля. В ходе выполнения настоящего проекта планируется изучить: 1) Эффект NADH, NAD+ и их биосинтетических предшественников, действующих со стороны цитозоля, на открывание mPTP в изолированных митохондриях печени, мозга, сердца и почек крыс. Это поможет определить орган(ы), наиболее чувствительные к действию изучаемых соединений и послужит выбору моделей для дальнейшего изучения. Кроме того, это поможет определить перспективные мишени при разработке терапии, основанной на подавлении mPTP через NAD(H)-связывающий сайт. 2) Механизм подавления mPTP цитозольным NAD(H), его связь с активацией/ингибированием ионного транспорта. Будет изучена NAD(H)-зависимая регуляция протонных утечек, а также транспорта калия с участием Са2+-зависимых и Са2+-независимых калиевых каналов и обменников во внутренней мембране митохондрий, т.е. процессов, регулирующих мембранный потенциал и объем митохондрий и, соответственно, прямо или опосредованно влияющих на индукцию mPTP. Это позволит выявить потенциальные мишени действия NAD(H) со стороны цитозоля. 3) Феномен (ранее не изученный) NAD(H)-зависимой активации выхода АТР и ADP (мощных ингибиторов mPTP) из митохондрий и его (пато)физиологическую роль. Планируется изучить основные биохимические характеристики NAD(H)-стимулируемого выхода адениновых нуклеотидов; с помощью ингибиторного анализа идентифицировать белок, ответственный за выход адениновых нуклеотидов (будут проверены ATP/ADP-транспортирующие и АТР/ADP-cинтезирующие белки); определить локализацию сайта действия NAD(H) - внешняя или внутренняя мембрана, межмембранное пространство (для этого будет сравнен эффект NADH и NAD в изолированных митохондриях и митопластах, а также в средах с разной тоничностью); изучить эффект NAD(H) на выход ATP/ADP из пермеабилизованных митохондрий, а также на устойчивость митохондрий к индукцию mPTP до и после удаления эндогенных адениновых нуклеотидов из митохондрий (преинкубация с фосфоенолпируватом). 4) Решение вышеуказанных задач позволит очертить круг кандидатов на роль NAD(H)-связывающего регулятора mPTР и перейти к его идентификации. В первую очередь, с использованием митохондрий и митопластов будет изучена локализация регуляторного сайта – внешняя мембрана или внешняя поверхность внутренней мембраны. При локализации регуляторного сайта во внешней мембране, его идентификация будет произведена с использованием аффинной хроматографии, регистрации автофлуоресценции NADH в полосах BN-PAGE гелей, и тандемной масс-спектрометрии. При локализации NAD(H)-связывающего регуляторного сайта в митопластах, планируется проводить масс-спектрометрический анализ супернатантов митопластов после обработки последних протеазами с параллельным контролем NAD(H)-зависимого подавления mPTP. Участие выявленных белков-кандидатов в подавлении mPTP будет верифицировано с использованием доступных ингибиторов и антагонистов, а также путем нокдауна или нокаута. 5) На заключительном этапе будет протестирована устойчивость клеток, экспрессирующих и не экспрессирующих NAD(H)-зависимый регулятор mРТР, к ишемии/гипоксии с использованием митохондриальных и клеточных моделей. Решение поставленных в проекте задач позволит идентифицировать новые механизмы участия пиридиновых нуклеотидов цитозоля в регуляции жизнеспособности клеток в физиологических и патологических состояниях. Полученные данные позволят начать поиск высокоэффективных фармакологических лигандов NAD(H)-зависимого регулятора mPTP и разработку новых способов терапии многих патологических состояний, в том числе, постишемических повреждений органов. Таким образом, предлагаемый проект направлен на решение важной медицинской, социальной и экономической проблемы.

Ожидаемые результаты
В ходе выполнения проекта планируется получить следующие результаты: 1. Будут получены данные о способности NADH, NAD и их предшественников никотинамида (NA) и мононуклеотида никотиновой кислоты (NaMN) ингибировать открывание mPTP в изолированных митохондриях печени, сердца, мозга, почек крыс. Будет сделано заключение о возможности использования данных соединений в терапии ишемических повреждений органов. Будет проведено сравнение эффективности данных соединений между собой и в разных объектах исследования. При обнаружении защитного эффекта NA и/или NaMN будет установлено, действуют ли данные соединения и NAD(H) через общий сайт или разные. Результаты будут использованы для идентификации NAD(H)-связывающего регулятора mPTP – для анализа наличия тканеспецифичных NAD(H)-связывающих белков в разных органах. Будет определен объект, наиболее подверженный действию изучаемых соединений и который может быть мишенью в дальнейшей разработке терапии, основанной на подавлении mPTP через NAD(H)-связывающий регуляторный сайт. Полученные данные будут необходимы для компьютерного моделирования взаимодействия субстрат-фермент в процессе разработки высокоаффинных нуклеотидных миметиков для блокирования mPTP в митохондриях, поскольку дадут представление о молекулярном строении раннее не идентифицированного сайта связывания NAD(H). Кроме того, полученные данные позволят определить максимальную эффективность нуклеотидных миметиков. Результаты будут опубликованы в качестве дополнительного материала к статье, описывающей идентификацию NAD(H)-зависимого регулятора mРТР. 2. Будет установлен механизм NAD(H)-зависимой активации выхода ATP/ADP из интактных митохондрий, идентифицирован сайт действия NAD(H), описаны количественные характеристики ускорения выхода ATP/ADP под действием пиридиновых нуклеотидов. Полученные данные будут использованы для определения физиологической роли NAD(H) в активации выхода ATP/ADP из митохондрий и влиянию данного процесса на индукцию mPTP. 3. Будут изучены эффекты NAD(H), оказываемые на выход ATP/ADP в условиях индукции mPTP, а также на устойчивость митохондрий к открыванию поры до и после удаления эндогенных адениновых нуклеотидов. Это поможет понять, каким образом связаны NAD(H)-зависимые процессы регуляции транспорта/продукции адениновых нуклеотидов и ингибирования открывания mPTP, реализуются ли они через единый сайт или разные. В последней случае будет установлен ранее не известный сайт регуляции жизнедеятельности клеток пиридиновыми нуклеотидами, который может стать новой мишенью для терапии различных заболеваний. Более того, данная работа принесет качественно новые фундаментальные знания об аллостерической регуляции метаболизма, о регуляции транспорта и/или синтеза адениновых нуклеотидов, о способах взаимной регуляции процессов, протекающих в разных компартментах клетки. Этот результат мирового уровня будет опубликован в международном журнале с IF не ниже 4 и входящем в первый квартиль (Q1). 4. Будут определены вклады Са2+-зависимых и Са2+-независимых калиевых каналов в эффекты NADH, NAD, их предшественников NA и NaMN, оказываемые на mPTP. 5. Будет выяснена роль и механизм действия цитозольных NADH, NAD, их предшественников NA и NaMN в контроле протонных утечек через внутреннюю мембрану митохондрий в нормальных условиях и в условиях ишемии/гипоксии, а также взаимосвязь данных процессов с открыванием mPTP. Идентифицированные сайты NAD(H)-зависимой регуляции протонных утечек и калиевого транспорта могут быть использованы в качестве мишеней для цитопротекции (в том числе, для регуляции открывания mPTP). Кроме того, полученные данные будут обладать фундаментальной ценностью для современной биологии, поскольку привнесут новые базовые знания в область биоэнергетики протекающих в клетке процессов, а именно, в понимание участия митохондрий в формировании внутриклеточных ионных градиентов. Результаты будут опубликованы в международном журнале с IF не ниже 3 и входящем в первый квартиль (Q1). 6. Будет установлена точная локализация внешнего NAD(H)-связывающего регулятора mPTP: внешняя мембрана, межмембранное пространство или внешняя сторона внутренней мембраны митохондрий. На основе этих данных будут определены NAD(H)-связывающие белки, которые с наибольшей вероятностью способны ингибировать открывание mPTP в присутствии цитозольного NAD(H). 7. Будет верифицирована роль выявленных предполагаемых внешних NAD(H)-связывающих регуляторов в подавлении mPTP, что позволит идентифицировать внешний NAD(H)-зависимый регулятор. Будут получены доказательства важной роли NAD(H)-зависимого регулятора mРТР (или ее отсутствия) в защите клеток в условиях ишемии/реперфузии. Этот результат мирового уровня будет опубликован в международном журнале с IF не ниже 5 и входящем в первый квартиль (Q1). Научное значение идентификации нового регулятора mPTP сложно переоценить. Такой результат положит начало развитию нового направления в исследовании функционирования mPTP в процессах запуска гибели клеток, их жизнеобеспечения и межмитохондриальной коммуникации. Он будет востребован в компьютерном моделировании и расчете энергии связывания NAD(H) с белком-регулятором, что является необходимым шагом для разработки новых препаратов для терапии постишемическая повреждений.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
1. Были проведены исследования по изучению влияния NADH, NAD+ и их биосинтетических предшественников никотинамида (NA) и мононуклеотида никотиновой кислоты (NaMN), оказываемого на индукцию mPTP в изолированных митохондриях печени (RLM), сердца (RHM), почек (RKM) и мозга крыс (RBM). Обнаружено, что во всех исследуемых типах митохондрий NADH и NAD+ оказывают дозозависимое ингибирующее действие на mPTP - тормозят Са2+-зависимое циклоспорин А-чувствительное набухание митохондрий и увеличивают их кальциевую емкость. RHM и RKM обладают наибольшей чувствительностью к действию NAD(H). Концентрации NAD(Н), вызывающие полумаксимальное ингибирование набухания митохондрий (IC50) равны: 1004 ± 87 µM (NADH) и 2259 ± 120 µM (NAD+) в RLM, 50 ± 12 µM (NADH) и 24 ± 4 µM (NAD+) в RHM, 70 ± 14 µM (NADH) и 97 ± 19 µM (NAD+) в RKM, 610 ± 37 µM (NADH) и 907 ± 62 µM (NAD+) в RBM. В концентрации 1 мM нуклеотиды увеличивают кальциевую емкость митохондрий следующим образом: в RLM - в 2,3 (NADH) и в 1,6 раз (NAD+), в RHM – в 6,5 (NADH) и в 8,5 раз (NAD+), в RKM – в 6,9 (NADH) и в 6,5 раз (NAD+), в RВM - в 1,7 (NADH) и в 1,5 раз (NAD+). Показано, что NA и NaMN не являются ингибиторами mPTP. 2. В рамках исследования процесса NAD(H)-зависимой активации выхода ATP/ADP из митохондрий и взаимосвязи данного процесса с открыванием mPTP были сравнены эффекты NAD(H) и NADP(H), оказываемые на выход АТР из изолированных митохондрий печени крыс. Обнаружено, что NADH и NAD+ дозозависимо стимулируют выход АТP. Кажущиеся Km для действия нуклеотидов равны: Km NADH = 36 ± 8,3 µМ, Km NAD+ = 41,3 ± 11,1 µМ. NADPH и NADP+ в концентрациях 0,244–500 µМ незначительно стимулировали выброс АТP, в концентрациях 0,5–1 мМ NADPH не влиял на выход АТP, а NADP+ ингибировал его (в 2,5 раза при концентрации 1 мМ). Добавление CATR или BA отменяло эффекты NAD(H), это указывает на то, что NAD(H)-стимулированный выход ATP опосредован работой ANT. Было проверено участие F0F1-АТР-синтазы и потенциалзависимых анионных каналов (VDAC) в исследуемом процессе. Для этого изучали: эффект специфического ингибитора F0F1-АТР-синтазы олигомицина в присутствии а-кетоглутарата; эффект NAD(H) на ADP-зависимую скорость дыхания RLM и поглощение ADP митохондриями; эффект NAD(H) в митохондриях с разрушенными контактами VDAC-ANT, а также в митопластах (митохондриях, лишенных внешней мембраны). Полученные данные подтверждают, что не F0F1-АТР-синтаза или VDAC, а ANT является мишенью действия NAD(H). 3. С использованием интактных и пермеабилизованных митохондрий, а также АТР-регенерирующей системы (фосфоенолпируват (РЕР) + пируваткиназа), было показано, что NAD(H) также индуцирует выход АDP из органелл. Поскольку АТР является мощным ингибитором mPTP, была проверена гипотеза о том, что снижение количества ATP в матриксе при добавлении NAD(H) должно стимулировать открывание поры. Для этого выход АТР предварительно вызывали добавлением PEP, это стимулировало открывание mPTP. Однако в присутствии NAD(H) инкубация митохондрий с РЕР не вызывает открывание mPTP. Таким образом, эффект NAD(H) достаточно силен, чтобы ингибировать открывание поры даже при потере матриксного АТР. Далее были изучены эффекты NADP(H), оказываемые на NAD(H)-зависимое ингибирование mPTP и выход АТP из митохондрий. Для этого были протестированы условно физиологические (0,5 и 1 мМ NAD+, 0,05 мM NADH, 0,5 и 1 мM NADPH, 0,025 и 0,05 мМ NADP+) и нефизиологические (0,5 мМ NADH, 1 мМ NADP+) концентрации нуклеотидов. Физиологические концентрации NADP+ не влияли на действие NADH и NAD+. Напротив, NADРН сильно подавлял NAD(H)-зависимые эффекты. Совместно все нуклеотиды в физиологических концентрациях увеличивают время полумаксимального набухания в 1,9 раз и выход АТР в 1,8 раз. Основной вклад в данные эффекты вносит NAD+, а NADPH является его антагонистом. Суммарный эффект NAD+ и NADH не увеличивался, что указывает на одинаковую мишень действия. Полученные данные подтверждают, что NAD(H) и NADP(H) могут быть конкурентами в зависимости от их концентрации, а кумулятивное действие пиридиновых нуклеотидов цитозоля, оказываемое на открывание mPTP и выход АТР из митохондрий, в нормальных условиях определяется главным образом NAD+ и NADPH. 4. Было показано, что ионы калия снижают ингибирующее действие NAD(H), оказываемое на mPTP: в KCl-, NaCl- и сахарозной средах IC50 = 1004 ± 87 µM (NADH) и 2259 ± 120 µM (NAD+); 16 ± 3 µM (NADH) и 37 ± 7 µM (NAD+); 58 ± 10 µM (NADH) и 134 ± 18 µM (NAD+), соответственно. Данный эффект проявляется при использовании в качестве дыхательных субстратов сукцината с ротеноном, но не глутамата с малатом. При этом ингибиторы и активаторы калиевых каналов глибенкламид, 5-гидроксидеканоевая кислота, диазоксид, пинацидил (регулируют митохондриальный АТР-зависимый калиевый канал), ибериотоксин (ингибитор большого Са2+-зависимого калиевого канала), Psora 4 (ингибитор потенциал-зависимых калиевых каналов), хинедин (ингибитор K+(Na+)/H+ обменника) не оказывают влияния на NAD(H)-зависимое ингибирование mPTP. Это свидетельствует о том, что митохондриальный калиевый транспорт, осуществляемый данными транспортерами, не задействован в механизмах регуляции mPTP пиридиновыми нуклеотидами. Были изучены механизмы влияния состава среды инкубации на mРТР. В KCl- и NaCl-средах набухание и падение ΔΨm в митохондриях инициировались в 4–8 раз быстрее, чем в сахарозной. Также митохондрии обладают наибольшей кальциевой емкостью в сахарозной среде (232 ± 26; в KCl -144,7 ± 28,6 и NaCl - 146 ± 24,4 нмоль/мг белка). Были определены концентрации KCl, ChCl, LiCl, NaCl, снижающие защитный эффект сахарозной среды на 50% (4,4 ± 1,5; 5,9 ± 1,8; 20,5 ± 3,2; 23,6 ± 7,3 мМ, соответственно). Действие модуляторов K+ каналов на открывание mPTP было либо слабым, либо неспецифическим для К+. Проведена работа по исследованию роли неселективного катионного канала, Ca2+/Na+ обменника и анионного канала внутренней мембраны митохондрий в запуске mPTP катионами. Показано, что данные транспортеры не участвуют в исследуемом процессе. Также фактором, определяющим чувствительность митохондрий к индукции mPTP в присутствии солей, не является скорость выброса Са2+ из митохондрий. Обнаружено, что открывание mPTP происходит наиболее быстро при кислом рН среды (6.8) и наиболее медленно при щелочном (7,6) во всех тестируемых средах. При всех протестированных значениях pH набухание в среде, содержащей катионы, происходило быстрее, чем в среде с сахарозой. рН матрикса в сахарозной среде значительно ниже, чем в солевых средах (~7,0 против 8,0-8,7). Добавление в среду Са2+ вызывало подщелачивание матрикса в сахарозной и подавляло закисление в солевых средах. В сахарозной среде А23187 (ионофор Са2+) усиливал Са2+-зависимое набухание, что свидетельствует о его работе в режиме входа Са2+ в обмен на матриксный Н+. В присутствии солей А23187 ингибирует открывание mPTP, так как более щелочной рН матрикса способствует выходу Са2+ в обмен на внешний Н+. В сахарозной среде происходит выброс К+ в инкубационную среду, соответствующий 25,7% от общего высвобождаемого аламетицином пула. В NaCl-среде выход К+ подавлен (16,5%). Обход оттока К+ через обменник К+/Н+ с помощью калиевого ионофора валиномицина предотвращал закисление матрикса в сахарозной среде и ускорял Ca2+-зависимое набухание, которое было чувствительно к ингибитору фосфатного переносчика N-этилмалеимиду. Таким образом, показано, что одновалентные катионы регулируют открывание mPTP, модулируя K+/H+- опосредованную регуляцию рН матрикса и транспорт фосфатов. Данные мишени действия катионов могут быть задействованы в NAD(H)-зависимом ингибировании mPTP. 5. По результатам исследования подготовлен манускрипт «Regulation of mitochondrial permeability transition pore opening by monovalent cations in liver mitochondria» E.S. Kharechkina et al. Также результаты представлены на 26-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI веках».

 

Публикации