КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 22-73-00190
НазваниеИспользование подхода OSMAC (один штамм – много соединений) для поиска перспективных «молекул-лидеров» из морских микроскопических грибов Penicillium thomii
РуководительЛещенко Елена Владиславовна, Кандидат химических наук
Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Дальневосточный федеральный университет", Приморский край
| Период выполнения при поддержке РНФ | 07.2022 - 06.2024 |
Конкурс№70 - Конкурс 2022 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.
Область знания, основной код классификатора 03 - Химия и науки о материалах, 03-103 - Синтез, строение и свойства природных и физиологически активных веществ; медицинская химия и прогнозирование различных видов биоактивности
Ключевые словабиологически активные соединения, вторичные метаболиты, морские грибы, противоопухолевая активность, антимикробная активность, OSMAC, ЯМР, ВЭЖХ
Код ГРНТИ31.23.00
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Онкологические заболевания и бактериальные инфекции являются причиной смерти миллионов человек ежегодно, как в развивающихся, так и в развитых странах. Согласно статистическим данным, рак является второй причиной смерти в мире, ежегодно унося более 9 млн жизней. Несмотря на значительный прогресс в диагностике лечения рака в последние десятилетия, в настоящий момент лечение онкопатологий все еще остается весьма проблематичным, как из-за отсутствия эффективных лекарств, так и из-за наличия у имеющихся препаратов серьезных побочных эффектов. Также одной из главных проблем современной медицины является возникновение антибиотик-устойчивых штаммов патогенных микроорганизмов. Постоянно увеличивающийся объем использования антибиотиков в медицине и сельском хозяйстве приводят к увеличению темпов выработки устойчивости к антимикробным препаратам и появлению штаммов резистентных к широкому спектру антибиотических препаратов. Таким образом, поиск новых антимикробных соединений, в особенности эффективных в отношении резистентных микроорганизмов, и противоопухолевых соединений является чрезвычайно важной и актуальной задачей.
Известно, что более 50% лекарственных препаратов созданы на основе соединений, выделенных из природных источников. Одним из подходов к созданию новых лекарственных препаратов, является поиск «молекул-лидеров» среди природных соединений, проявляющих желаемую биологическую активность. Поэтому выделение новых биологически активных природных соединений является важной фундаментальной задачей на пути к поиску «молекул-лидеров» – основы для создания лекарственных препаратов.
Известно, что морские микроорганизмы являются источником новых природных соединений с широким спектром биологической активности, применимой в различных отраслях промышленности. Постоянно растущее количество секвенированных микробных геномов выявило несоответствие между количеством генных кластеров потенциально кодирующих производство метаболитов и фактического количества химически охарактеризованных метаболитов, выделенных из данных микроорганизомов. Гомологическая и гетерологичная экспрессия этих биосинтетических генов, которые часто не активны в условиях экспериментального лабораторного культивирования, может привести к открытию «скрытых» природных соединений, представляющих медицинский и биотехнологический интерес. Подход OSMAC (один штамм — много соединений), основанный на модификации условий роста, оказался мощной стратегией для открытия новых потенциально активных природных соединений.
В проекте в качестве объектов исследования будут использованы ранее нами изученные грибы-микромицеты Penicillium thomii, выделенные из морских бурых водорослей и морской травы, зарекомендовавшие себя в качестве продуцентов противоопухолевых и противовоспалительных соединений. В рамках первичных химических исследований, проведенных по «классическому» пути в области химии природных соединений, полностью биосинтетический потенциал этих грибов раскрыт не был. Таким образом, данный проект предусматривает выявление скрытых «лидерных» молекул из этих объектов для дальнейшей разработки на их основе новых антибиотиков и противоопухолевых соединений. Для вторичных метаболитов грибов, выделенных в рамках проекта, будут впервые получены данные об их антимикробной активности, а также цитотоксичности в отношении урогенитальных опухолей человека и ряда неопухолевых клеток, что позволит выбрать наиболее перспективные соединения для дальнейшей разработки лекарственных препаратов. Результаты исследований, планируемых в рамках данного проекта, существенно расширят арсенал природных соединений новыми вариантами химических структур. Это позволит охарактеризовать биосинтетические возможности морских микроскопических грибов и целенаправленно использовать их в качестве продуцентов для получения новых вариантов биоактивных соединений. Таким образом, в нашем распоряжении окажется доступный и возобновляемый источник новых природных соединений, обладающих антимикробной и противоопухолевой активностью.
Ожидаемые результаты
Проект предусматривает подбор оптимальных условий культивирования по стратегии OSMAC ранее изученных нами грибов Penicillium thomii КММ 4674 и P. thomii КММ 4667, ассоциированных с морской травой Zostera marina (Японское море), P. thomii КММ 4675 (морская бурая водоросль Sargassum pallidum, Японское море) и P. thomii КММ 4645 (морская бурая водоросль Sargassum miyabei, Японское море) с целью увеличения выхода биоактивных соединений и/или активации спящих генов отвечающих за синтез «скрытых» метаболитов. Согласно стратегии OSMAC в рамках данного проекта планируется изменить химические условия культивирования, варьируя соленость (осмотический стресс) и добавляя катионы металлов.
Проект предусматривает выделение и установление строения индивидуальных соединений в результате препаративного культивирования гриба Penicillium thomii на специально подобранной модифицированный среде согласно стратегии OSMAC. Будут получены данные о влиянии осмотического стресса (солености) и катионов металлов (Mg2+, Zn2+, Fe3+, Ni2+) на биосинтез низкомолекулярных вторичных метаболитов. Будут получены данные о противомикробном действии выделенных соединений как непосредственно в отношении наиболее типичных представителей грамположительных и грамотрицательных бактерий и дрожжеподобных грибов (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans), так и через ингибирование некоторых специфичных микробиальных ферментов (сортаза, уреаза). Будут получены данные о противоопухолевой активности выделенных соединений в отношении ряда клеточных линий рака простаты человека, в том числе лекарственно-устойчивых, а также данные о цитотоксичности выделенных соединений.
Результаты исследований существенно расширят арсенал природных соединений-антибиотиков, а также соединений с противоопухолевой активностью в отношении рака простаты человека. Некоторые из этих соединений могут стать основой для создания лекарственных препаратов.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В период с 20 июля 2022 года по 15 мая 2023 года в рамках проекта «Использование подхода OSMAC (один штамм – много соединений) для поиска перспективных «молекул-лидеров» из морских микроскопических грибов Penicillium thomii» №22-73-00190 были выполнены следующие научно-исследовательские работы:
Проведен анализ хроматографических профилей 146 экстрактов четырех ранее изученных штаммов морских грибов рода Penicillium, полученных при культивировании в условиях осмотического стресса и с добавлением солей металлов согласно стратегии OSMAC. Для штамма P. thomii КММ 4674 (морская трава Zostera marina, Японское море) была проведена реидентификация на основе молекулярно-генетических признаков, с использованием маркеров ITS и β-тубулина. BLAST анализ показал, что штамм КММ 4674 на 100% идентичен Penicillium velutinum NRRL2069. Экстракты грибов были проанализированы методами тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографией с УФ-детекцией. Выявлено, что штамм KMM 4674 значительно увеличивает биосинтез среднеполярных соединений при культивировании с добавлением солей железа (III), цинка (II) и никеля (II). В то же время при культивировании с этими же солями в хроматографическом профиле штамма P. thomii КММ 4645 происходит обеднение средне-полярной части, при этом наблюдается увеличение интенсивности пиков в неполярной области. Были подобраны условия препаративного культивирования P.velutinum согласно стратегии OSMAC.
Проведен скрининг 54 отобранных экстрактов на их противомикробную активность в отношении грамположительных бактерий Staphylococcus aureus, грамотрицательных бактерий Escherichia coli и дрожжеподобных грибов Candida albicans, а также изучено цитотоксическое действие десяти отобранных экстрактов в отношении опухолевых клеток рака простаты человека PC-3 и нормальных клеток почки эмбриона человека HEK 293T. Выявлен экстракт гриба Penicillium thomii КММ 4645, полученный в результате культивирования в гипосолевых условиях и показавший значительную противомикробную активность в отношении S. aureus и E. coli (46,2 % и 35,2 % соответственно). При этом увеличение времени культивирования этого образца до 1,5 месяцев позволило зафиксировать более сильное ингибирование роста S. aureus, чем при культивировании в течение трех недель. Выявлены 12 экстрактов P. velutinum КММ 4674 и один экстракт P. thomii КММ 4645 с самым выраженным противомикробным действием в отношении C. albicans, показавшие селективное ингибирование роста дрожжеподобных грибов, при этом не ингибируя рост бактерий. Изучение цитотоксического действия некоторых полученных экстрактов, показало, что они не обладали выраженным цитотоксическим действием в отношении клеточных линий РС-3 и HEK-293, в концентрации 100 мкг/мл. Большинство экстрактов снижало жизнеспособность клеток РС-3 и НЕК-293 на 35-45%. Экстракт P. velutinum КММ 4674 полученный в гиперсолевых условиях снизил жизнеспособность раковых клеток PC-3 на 55%, в то время как жизнеспособность нормальных клеток HEK-293 снизилась на 85%. Экстракт, полученный при культивировании с солью железа (III) неожиданно показал минимальную цитотоксичность в отношении обеих клеточных линий.
Проведено хроматографическое разделение этилацетатного экстракта Penicillium velutinum КММ 4674, полученного при культивировании с солью железа (III), в результате чего выделен известный сесквитерпен гваяанового типа совместно с пятью неидентифицированными алкалоидами, установление структур которых запланировано в 2023–2024 году.
Проведен анализ отобранных экстрактов и выделенных индивидуальных соединений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрической детекцией. В результате в экстрактах были идентифицированы четыре известных грибных метаболита. Также в экстрактах были обнаружены метаболиты, ранее выделявшиеся из этого штамма при культивировании в стандартных условиях. На основании полученных данных была построена тепловая карта всех проанализированных экстрактов гриба Penicillium velutinum КММ 4674, показывающая относительное содержание метаболитов в каждом экстракте. В результате проведенного исследования была освоена методика эффективного масштабного скрининга для выявления перспективных объектов исследования, без необходимости препаративного культивирования и хроматографического разделения экстрактов.
Публикации