КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 22-64-00041
НазваниеАптамеры как инструменты повышения противоопухолевой эффективности онколитического вируса VV-GMCSF-Lact для терапии злокачественных опухолей головного мозга
РуководительКулигина Елена Владимировна, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирская обл
| Годы выполнения при поддержке РНФ | 2022 - 2025 |
КонкурсКонкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по поручениям (указаниям) Президента Российской Федерации» (междисциплинарные проекты)
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология
Ключевые словаонколитический вирус, виротерапия, опухоли головного мозга человека, персонализированные 3D –клеточные культуры, аптамеры, нейтрализующие антитела
Код ГРНТИ34.15.51
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Глиомы III - IV степени злокачественности – самые агрессивные опухоли головного мозга, характеризующиеся высокой летальностью и высокой частотой рецидивов. Стандартные методы терапии - хирургическая резекция с последующей химиотерапией темозоломидом и лучевой терапией не приводят к выздоровлению пациента и/или значительному увеличению выживаемости. Таким образом, разработка новых стратегий лечения и эффективных лекарственных препаратов представляет собой важную биомедицинскую задачу.
Отсутствие релевантных доклинических моделей глиом не позволяет оценить истинную эффективность инновационных противоопухолевых препаратов. Для тестирования противоопухолевых препаратов нового поколения необходимо использовать релевантные клеточные модели, первичные 3D – культуры, полученные из образцов ткани пациентов с диагнозом глиома. Модельная опухоль у животных должна состоять из зоны инвазивного роста, некротической центральной области и зоны патологического роста сосудов. В проекте будет использована ортотопическая модель 3D–культуры глиомы человека, разработанная и внедренная сотрудниками КрасГМУ на мышах с лекарственной иммуносупрессией. Использование животных с иммуносупрессией позволит оценить терапевтический потенциал исследуемого лекарственного средства у онкологических пациентов с иммунной недостаточностью.
Онколитическая виротерапия является перспективным подходом для лечения онкологических заболеваний в связи с селективностью поражения опухолевых клеток, возможностью иммуномодуляции организма пациента и использования совместно с химио- и лучевой терапией. ИХБФМ СО РАН совместно с ГНЦ ВБ «Вектор» разработал противоопухолевое лекарственное средство на основе рекомбинантного штамма VV-GMCSF-Lact вируса осповакцины. В 2019 г. успешно завершены доклинические исследования VV-GMCSF-Lact как препарата для терапии опухолей молочной железы. Клинические испытания препарата проходят на базе ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России, г. Санкт-Петербург. Данные о клинических испытаниях размещены в базе данных ClinicalTrials.gov.
Ранее, в экспериментах на культурах клеток было показано, что VV-GMCSF-Lact обладает высокой онколитической активностью по отношению к опухолям головного мозга. Для изучения противоопухолевой эффективности вируса в отношении опухолей внутричерепной локализации целесообразно исследовать внутривенный способ введения препарата как наименее инвазивный. При введении в организм вирус провоцирует выработку вирус-нейтрализующих антител, которые могут снижать его противоопухолевый эффект. Экранировать вирусы от влияния иммунной системы можно с помощью аптамеров, покрывающих оболочку вирусной частицы. Сотрудники
КрасГМУ имеют как опыт селекции аптамеров, защищающих вирусные частицы онколитической осповакцины от действия нейтрализующих антител, так и опыт математического моделирования новых аптамеров. В настоящем проекте предполагается сконструировать бифункциональный аптамер одновременно для защиты VV-GMCSF-Lact от нейтрализующих антител и для адресной доставки вирусных частиц к опухолевым клеткам глиом.
Таким образом, при выполнении проекта оценка противоопухолевого потенциала VV-GMCSF-Lact будет проведена на релевантных опухолевых моделях: первичных 3D–культурах глиом человека, полученных из образцов опухолей пациентов и трансплантированных животным с лекарственной иммуносупрессией. Для увеличения терапевтического потенциала рекомбинантного вируса VV-GMCSF-Lact будут впервые использованы аптамеры, ингибирующие агрегацию вирусных частиц, защищающие вирусные частицы от действия нейтрализующих антител и способствующие адресной доставке вирусов к опухолевым клеткам.
Для успешной реализации проекта необходима слаженная работа междисциплинарного коллектива, объединяющего специалистов разного профиля – молекулярных биологов, биохимиков и нейрохирургов. В данном проекте предполагается совместная работа сотрудников ИХБФМ СО РАН и КрасГМУ.
Ожидаемые результаты
В рамках выполнения проекта будут получены следующие результаты:
1. Получение первичных 3D-культур клеток из образцов глиальных опухолей пациентов, отражающих морфологию глиомы высокой степени злокачественности (работа будет проведена совместно сотрудниками ИХБФМ СО РАН и КРасГМУ).
2. Создание молекулярных конструкций бифункциональных аптамеров, оптимизированных с помощью компьютерного моделирования, для одновременной защиты вирусов от иммунной системы и адресной доставки к глиальным опухолям головного мозга (работа будет проведена сотрудниками КрасГМУ).
3. Оценка агрегации вирусных частиц VV-GMCSF-Lact при инкубации с аптамерами NV-2, NV-46, NV-14, специфичными к вирусу осповакцины, и бифункциональными аптамерами in vitro (работа будет проведена сотрудниками ИХБФМ СО РАН).
4. Оценка эффективности защиты VV-GMCSF-Lact от нейтрализующих антител при использовании аптамеров NV-2, NV-46, NV-14, специфичных к вирусу осповакцины, и бифункциональных аптамеров in vitro (работа будет проведена сотрудниками ИХБФМ СО РАН).
5. Определение оптимальных соотношений аптамеров и VV-GMCSF-Lact в препаратах VV-GMCSF-Lact-Apt 1 (VV-GMCSF-Lact и аптамеры, специфичные к вирусу осповакцины) и VV-GMCSF-Lact-Apt2 (VV-GMCSF-Lact и бифункциональные аптамерные конструкции к глиоме и вирусу оспавакцины) (работа будет проведена сотрудниками ИХБФМ СО РАН).
6. Оценка цитотоксической активности вирусных препаратов VV-GMCSF-Lact, VV-GMCSF-Lact-Apt1 и VV-GMCSF-Lact-Apt2 в отношении первичных 3D – культур глиальных опухолей головного мозга in vitro (работа будет проведена сотрудниками ИХБФМ СО РАН).
7. Оценка проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) для препаратов VV-GMCSF-Lact, VV-GMCSF-Lact-Apt1 и VV-GMCSF-Lact-Apt2 в клеточной модели гематоэнцефалического барьера in vitro с полупроницаемой мембраной («ГЭБ in vitro»).
8. Оценка противоопухолевой эффективности вирусных препаратов VV-GMCSF-Lact, VV-GMCSF-Lact-Apt1 и VV-GMCSF-Lact-Apt2 в отношении ксенотрансплантатов глиом, полученных при ортотопической трансплантации мышам с лекарственной иммуносупрессией первичных 3D - культур глиом (работа будет проведена совместно сотрудниками ИХБФМ СО РАН и КРасГМУ).
9. Оценка биораспределения VV-GMCSF-Lact-Apt1 и VV-GMCSF-Lact-Apt2 по сравнению с VV-GMCSF-Lact в мышах с иммуносупрессией и с ортотопически трансплантированными первичными клеточными 3D - культурами глиом человека (работа будет проведена совместно сотрудниками ИХБФМ СО РАН и КРасГМУ).
10. Оценка экспрессии ключевых цитокинов (IL-1, IL-10, TNF-alpha и TGF-β1), а также морфологических изменений опухолевой ткани и органов (печень, почки, селезенка, легкие) животных, после введения VV-GMCSF-Lact-Apt1, VV-GMCSF-Lact-Apt2 и VV-GMCSF-Lact в качестве контроля (работа будет проведена сотрудниками ИХБФМ СО РАН).
Исследования, запланированные при выполнении данного проекта, с использованием противоопухолевых препаратов (VV-GMCSF-Lact, VV-GMCSF-Lact-Apt1, VV-GMCSF-Lact-Apt2), релевантных опухолевых моделей первичных 3D- культур, полученных из образцов опухолей пациентов, и мышей с лекарственной иммуносупрессией и ортотопической ксенотрансплантацией открывают перспективу создания инновационного подхода для терапии пациентов со злокачественными новообразованиями головного мозга. Помимо этого, данные, полученные в ходе решения задач настоящего проекта, позволят оценить эффективность аптамеров как ингибиторов агрегации вирусных частиц, возможность их использования для минимизации противовирусного иммунного ответа и адресной доставки к опухолевым клеткам при применении противоопухолевых лекарств этого класса.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Одной из причин отсутствия значимых достижений в области лекарственной терапии глиальных опухолей мозга является недостаточная релевантность моделей глиобластомы, используемых в доклинических исследованиях противоопухолевых препаратов. В данном проекте в качестве опухолевых моделей решено было использовать первичные 3D – культуры, полученные из образцов опухолей пациентов с диагнозом глиома III – IV степени злокачественности. Такие культуры отражают физиологию процесса развития опухоли, близкую к таковой в организме человека при развитии заболевания, и содержат зону инвазивного роста, некротическую центральную область и зону патологического роста сосудов.
Для реализации данной задачи из фрагментов хирургически резецированной опухолевой ткани пациентов были получены первичные клеточные культуры. За отчетный период получены и охарактеризованы 4 клеточных культуры, две из которых (№1 и №2) сохранены (криоконсервация) в коллекции культур клеток ЛБТ ИХБФМ СО РАН. Последующий гистологический анализ показал, что не все использованные для получения первичных культур опухоли относятся к глиомам III – IV степени злокачественности. Образец №1 был получен из диффузной астроцитомы человека (G4 по ВОЗ, полиморфноклеточная глиобластома), а образец №4 - из анапластической астроцитомы (G3 по ВОЗ), что соответствовало планам исследования, а образцы №2 и №3 гистологически соответствуют гемистоцитарной астроцитоме человека (G2 по ВОЗ) и атипической менингиоме (G2 по ВОЗ), соответственно. С другой стороны, расширение панели клеточных культур, включение в исследование других нозологических форм, менее злокачественных, прогностически благоприятных и поддающихся лечению, является преимуществом, так как в перспективе дает шанс на выздоровление на более ранних стадиях развития опухолевого процесса.
Цитотоксическая активность онколитического вируса была оценена с использованием колориметрического теста «Deep Blue Cell Viability», который основан на оценке метаболической активности живых клеток. В процессе данного эксперимента цитотоксическая активность онколитического вируса VV-GMCSF-Lact была определена для клеток первичных культур, полученных из образцов опухолей №1 - №3, жизнеспособность клеток культуры №4 оказалась чрезвычайно низкой, что не позволило провести тест. Результаты колориметрического теста для клеток первичных культур №1 - №3 были проанализированы с помощью программы CompySin. Согласно полученным результатам чувствительность клеток первичных культур к онколитическому вирусу VV-GMCSF-Lact (IC50) оказалась следующей: №2 (IC50 =3.62E-4) > №1. a (IC50=0.13161) > №1. n (IC50=0.21052) >№3 (IC50 =0.95363). Таким образом, самыми устойчивыми к действию онколитическому вирусу оказались клетки первичной 3D–культуры №3, самыми чувствительными – клетки культуры №2. Стоит отметить, что при культивировании клеток в условиях формирования нейросфер мы получили более устойчивую к действию онколитического вируса культуру №1n, что соответствует литературным данным.
С помощью математического моделирования построены полноатомные модели пяти аптамеров, специфичных к онколитическому вирусу VV-GMCSF-Lact, отражающие наиболее вероятную конформацию аптамеров в растворе. Первичные последовательности аптамеров к онколитическому вирусу осповакцины были взяты из ранее опубликованной работы членов Красноярской команды. Моделирование соответствующих пространственных полноатомных структур проведено с помощью программ VMD и SimRNA. Cтруктуры аптамеров 8NV37_1, 8NV37_2, 8NV37_4 характеризовались наличием достаточно больших одноцепочечных участков, что обуславливает их высокую конформационную подвижность в растворе. В свою очередь, расположение комплементарных пар в аптамерах 8NV37_6 и 8NV37_14 может приводить к образованию компактных и менее подвижных структур. В результате анализа полученных данных выявлены потенциальные сайты связывания аптамера с вирусом и определены нуклеотиды аптамера, обеспечивающие связывание с вирусной частицей, и нуклеотиды, поддерживающие геометрию сайта связывания.
Таким образом, все работы, запланированные на первый этап проекта (2022 г), выполнены полностью.
По результатам выполнения проекта подготовлены и направлены в печать 2 научные статьи:
1. «Development of DNA Aptamers for Visualization of Glial Brain Tumors and Detection of Circulating Tumor Cells» Molecular Therapy - Nucleic Acids,Q1 (статус – ожидание отрецензированной версии)
2. «Aptamers as tools for enhancing the antitumor efficacy of oncolytic viruses», Pharmaceutics, Q1 (статус – на рецензии)
Публикации
1. Кичкайло А.С., Народов А.А., Комарова М.А., Замай Т.Н., Замай Г.С., и др. ...Березовский М.В. Development of DNA Aptamers for Visualization of Glial Brain Tumors and Detection of Circulating Tumor Cells Molecular Therapy - Nucleic Acids, - (год публикации - 2023)
2. Дымова М.А., Кичкайло А.С., Кулигина Е.В., Рихтер В.А. Aptamers as tools for enhancing the antitumor efficacy of oncolytic viruses Pharmaceutics, - (год публикации - 2023)