Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Одной из причин отсутствия значимых достижений в области лекарственной терапии глиальных опухолей мозга является недостаточная релевантность моделей глиобластомы, используемых в доклинических исследованиях противоопухолевых препаратов. В данном проекте в качестве опухолевых моделей решено было использовать первичные 3D – культуры, полученные из образцов опухолей пациентов с диагнозом глиома III – IV степени злокачественности. Такие культуры отражают физиологию процесса развития опухоли, близкую к таковой в организме человека при развитии заболевания, и содержат зону инвазивного роста, некротическую центральную область и зону патологического роста сосудов. Для реализации данной задачи из фрагментов хирургически резецированной опухолевой ткани пациентов были получены первичные клеточные культуры. За отчетный период получены и охарактеризованы 4 клеточных культуры, две из которых (№1 и №2) сохранены (криоконсервация) в коллекции культур клеток ЛБТ ИХБФМ СО РАН. Последующий гистологический анализ показал, что не все использованные для получения первичных культур опухоли относятся к глиомам III – IV степени злокачественности. Образец №1 был получен из диффузной астроцитомы человека (G4 по ВОЗ, полиморфноклеточная глиобластома), а образец №4 - из анапластической астроцитомы (G3 по ВОЗ), что соответствовало планам исследования, а образцы №2 и №3 гистологически соответствуют гемистоцитарной астроцитоме человека (G2 по ВОЗ) и атипической менингиоме (G2 по ВОЗ), соответственно. С другой стороны, расширение панели клеточных культур, включение в исследование других нозологических форм, менее злокачественных, прогностически благоприятных и поддающихся лечению, является преимуществом, так как в перспективе дает шанс на выздоровление на более ранних стадиях развития опухолевого процесса. Цитотоксическая активность онколитического вируса была оценена с использованием колориметрического теста «Deep Blue Cell Viability», который основан на оценке метаболической активности живых клеток. В процессе данного эксперимента цитотоксическая активность онколитического вируса VV-GMCSF-Lact была определена для клеток первичных культур, полученных из образцов опухолей №1 - №3, жизнеспособность клеток культуры №4 оказалась чрезвычайно низкой, что не позволило провести тест. Результаты колориметрического теста для клеток первичных культур №1 - №3 были проанализированы с помощью программы CompySin. Согласно полученным результатам чувствительность клеток первичных культур к онколитическому вирусу VV-GMCSF-Lact (IC50) оказалась следующей: №2 (IC50 =3.62E-4) > №1. a (IC50=0.13161) > №1. n (IC50=0.21052) >№3 (IC50 =0.95363). Таким образом, самыми устойчивыми к действию онколитическому вирусу оказались клетки первичной 3D–культуры №3, самыми чувствительными – клетки культуры №2. Стоит отметить, что при культивировании клеток в условиях формирования нейросфер мы получили более устойчивую к действию онколитического вируса культуру №1n, что соответствует литературным данным. С помощью математического моделирования построены полноатомные модели пяти аптамеров, специфичных к онколитическому вирусу VV-GMCSF-Lact, отражающие наиболее вероятную конформацию аптамеров в растворе. Первичные последовательности аптамеров к онколитическому вирусу осповакцины были взяты из ранее опубликованной работы членов Красноярской команды. Моделирование соответствующих пространственных полноатомных структур проведено с помощью программ VMD и SimRNA. Cтруктуры аптамеров 8NV37_1, 8NV37_2, 8NV37_4 характеризовались наличием достаточно больших одноцепочечных участков, что обуславливает их высокую конформационную подвижность в растворе. В свою очередь, расположение комплементарных пар в аптамерах 8NV37_6 и 8NV37_14 может приводить к образованию компактных и менее подвижных структур. В результате анализа полученных данных выявлены потенциальные сайты связывания аптамера с вирусом и определены нуклеотиды аптамера, обеспечивающие связывание с вирусной частицей, и нуклеотиды, поддерживающие геометрию сайта связывания. Таким образом, все работы, запланированные на первый этап проекта (2022 г), выполнены полностью. По результатам выполнения проекта подготовлены и направлены в печать 2 научные статьи: 1. «Development of DNA Aptamers for Visualization of Glial Brain Tumors and Detection of Circulating Tumor Cells» Molecular Therapy - Nucleic Acids,Q1 (статус – ожидание отрецензированной версии) 2. «Aptamers as tools for enhancing the antitumor efficacy of oncolytic viruses», Pharmaceutics, Q1 (статус – на рецензии)

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Проведена оценка противоопухолевой эффективности VV-GMCSF-Lact в отношении ксенотрансплантатов глиобластомы, полученных при ортотопической трансплантации мышам с неполной лекарственной иммуносупрессией клеток первичных 3D-культур глиом человека, при курсовом и однократном введении вируса. Противоопухолевый эффект вируса оценен по результатам МРТ, а также по выживаемости животных в экспериментальной и контрольной группах. На основании анализа МРТ сканирования мозга мышей – опухоленосителей показано, что уже после второго введения препарата зона накопления контрастного вещества уменьшается по сравнению с однократным введением, после третьего введения зона контрастного вещества, а также область вазогенного отека не визуализируется. Анализ выживаемости экспериментальных животных с ортотопически трансплантированной глиомой человека подтвердил противоопухолевую эффективность VV-GMCSF-Lact как при однократном, так и при курсовом внутривенном введении вирусного препарата. При курсовом введении препарата наблюдалось небольшое повышение температуры тела экспериментальных животных, что является защитно-приспособительной реакцией организма на вирусную инфекцию. Исследование биораспределения VV-GMCSF-Lact в организме экспериментальных животных с ортотопически трансплантированными глиомами человека при однократном и курсовом (3 – 4 инъекции с интервалом в неделю) внутривенном введении вируса показало, что вирус элиминируется из организма на 7 сутки после введения. Элиминация вируса может быть обусловлена как его быстрым онколитическим эффектом в отношении клеток опухоли и невозможностью дальнейшей эффективной репликации, так и активацией иммунной системы после окончания периода иммуносупрессии (14 дней). Проведена оценка экспрессии ключевых цитокинов (IL-1, IL-10, TNF-alpha и TGF-β1) и морфологические изменения опухолевой ткани при терапии глиом человека вирусом VV-GMCSF-Lact. Показано, что IL-1 присутствует во всех экспериментальных образцах, однако его концентрация статистически не отличается в анализируемом временном диапазоне (с 1 по 5 день); уровни цитокинов TNF-α и TGF-β в плазме крови мышей сильно варьируют и статистически значимых отличий в опытных и контрольных группах не обнаружено. Таким образом, установлено, что внутривенное введение VV-GMCSF-Lact не влияет на уровень цитокинов IL-1β, IL-10, TNF-α, TGF-β1 в плазме крови мышей-опухоленосителей с интракраниально трансплантированной глиомой человека, через 1, 3, 5 суток после лечения вирусным препаратом. Для понимания деталей цитокинового ответа мышей-опухоленосителей с неполной иммуносупрессией на введение вируса необходимы дополнительные исследования, в частности, анализ образцов крови до, во время и после проведения иммуносупрессии, а также во время и после лечения вирусом. Микроскопический анализ морфологических изменений опухолевой ткани и мозга экспериментальных животных через 1, 3, 5 суток после введения вирусного препарата (VV-GMCSF-Lact) показал: - в группе контроля без лечения выявлены скопления опухолевых клеток веретенообразной и полиморфной формы с тонким ободком цитоплазмы и гиперхромными ядрами. В центре опухолевого узла определялся массивный очаг деструкции опухолевой ткани, представленный бесструктурными участками некроза, инфильтрированными гранулоцитами. - внутривенное введение VV-GMCSF-Lact приводит к значительному нарастанию очагов деструкции в ткани опухоли и уменьшению участков головного мозга, инфильтрированных опухолевыми клетками, через 1 сутки после лечения по сравнению с контролем. - через 3 суток после введения VV-GMCSF-Lact наблюдались не только признаки деструкции опухолевой ткани, но и уменьшение размеров самой опухоли по сравнению с контролем. Обнаружена более выраженная воспалительная инфильтрация опухолевого узла, что может свидетельствовать не только о цитопатическом действии вируса, но и о включении иммунных механизмов уничтожения опухоли. - через 5 суток после введения вирусного препарата в ткани головного мозга определялся лишь участок, куда были трансплантированы опухолевые клетки без выраженных признаков опухолевого роста. МРТ-сканирование мозга мышей-опухоленосителей до лечения вирусом VV-GMCSF-Lact и на третьи и пятые сутки после лечения показало достоверное уменьшение размеров опухолей животных экспериментальной группы по сравнению с контрольной. Иммуногистохимическое окрашивание срезов головного мозга антителами к про-воспалительному цитокину IL1b продемонстрировало нарастание его экспрессии как в опухолевой ткани или ее остатках, так и в ткани головного мозга, прилегающей к опухоли, после введения вирусного препарата VV-GMCSF-Lact по сравнению с контролем без лечения. На основе анализа особенностей структуры полноразмерных аптамеров, специфичных к ортопоксвирусу, были предложены варианты уменьшения нуклеотидной последовательности аптамеров с сохранением структурных особенностей соответствующих участков исходных аптамеров. По результатам экспериментальной оценки аффинности укороченных аптамеров к онколитическому вирусу аптамер NV14t_57 выбран для моделирования бифункциональных аптамеров. На основе данных динамического светорассеяния показано, что аптамер NV14t_57 обволакивает вирусные частицы и препятствуют их агрегации. Добавление аптамера к вирусу VV-GMCSF-Lact не повлияло на средние значения дзета - потенциала. Эксперименты с использованием микроскопического термофореза (MST) показали, что аптамеры связываются с вирусом (EC50 = 1,487×10E+9 БОЕ/мл). Анализ амплитуд кривых MST свидетельствует о том, что компоненты сыворотки связываются с комплексом аптамер-вирус, не разрушая его. Проведены эксперименты in vitro по влиянию аптамера на цитотоксичность VV-GMCSF-Lact в отношении клеток глиобластомы человека U87 MG в присутствии сыворотки крови человека с/без нейтрализующих антител. Путём соединения аптамера NV14t_57 с аптамерами Gli-35 и Gli-233, специфичными к клеткам глиом, получены гибридные бифункциональные аптамеры. Все работы, запланированные в проекте на 2023 год, выполнены в полном объеме. Полученные результаты соответствуют поставленным задачам проекта на 2023 год.