Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Проблема поиска новых биологически активных веществ (БАВ), проявляющих антибактериальное действие, является одной из наиболее актуальных в современной медицине и фармации вследствие постоянно возрастающей резистентности бактериальных штаммов к известным противомикробным препаратам. В этой связи, важным направлением исследований представляется поиск новых БАВ природного происхождения. Для решение такой задачи необходимы специальные высокоэффективные методы и подходы фармацевтического скрининга, позволяющие выявить антимикробный эффект при анализе большого количества образцов. Именно на это и направлен данный проект, в ходе работы над которым, планируется разработка метода скрининга антибиотической активности с использованием морских и рекомбинантных биолюминесцентных тест-обьектов. Одной из задач первого года выполнения проекта был подбор оптимальных биосенсорных тест-штаммов, чувствительных к антибактериальному действию лекарственных веществ. На этом этапе были получены пять новых штаммов биолюминесцентных бактерий, которые с помощью биохимических и микробиологических методов были идентифицированы как Photobacterium leiognathi, Aliivibrio fischeri и Vibio harveyi. Эти штаммы вошли в Коллекцию морских биолюминесцентных бактерий Лаборатории биохемилюминесцентных аналитических технологий (Л-БАТ). Для выбора оптимальных тест-обьектов была изучена чувствительность биолюминесценции выделенных бактерий к действию ряда лекарственных веществ-антибиотиков с различным механизмом антибактериального действия, а также 20 лекарственных веществ из различных фармакологических групп, не обладающих антибиотической активностью. Проведённые исследования позволили выбрать два тест-объекта P. leiognathi Sh1 и A. fischeri F1, которые обладали высокой чувствительностью к антимикробному действию лекарственных веществ и были использованы в дальнейшей работе. Также на первом этапе выполнения проекта произведена оценка применимости 5 рекомбинантных биолюминесцентных тест-объектов на основе E.coli MG1655 и разработаны условия для биотестирования антибиотической активности. Установлено, что E. coli MG1655 (pXen7) с конститутивным типом люминесценции применим для выявления антибактериальной активности веществ против грамотрицательных бактерий. Lux-биосенсоры (биолюминесцентные биорепортеры) E. coli MG1655 (pRecA-lux) и E. coli MG1655 (pColD-lux), обладающие индуцибельной биолюминесценцией, позволяют выявить антибактериальную активность, связанную с повреждением нуклеиновых кислот. Бактерии E. coli MG1655 (pKatG-lux) и E. coli MG1655 (pSoxS-lux) являются оптимальными тест-объектами для оценки антибактериальной активности, вызванной окидативным стрессом. В общей сложности в мире исследовано более 459 растительных антибактериальных соединений из порядка 183 видов растений. В данном проекте была произведена оценка применимости выбранных биолюминесцентных тест-обьектов для выявления и анализа антибиотической активности ряда представителей таких классов лекарственных веществ растительного происхождения, как алкалоиды, флавоноиды, фенольные соединения, танины (дубильные вещества) и терпены. Произведена оптимизация соответствующих методик проведения биотестирования. Полученные результаты подтвердили высокую антибактериальную активность большинства исследованных лекарственных веществ растительного происхождения и показали применимость выбранных тест-объектов и используемых методик для выявления антибиотического действия. Установлено, что для многих веществ характерно увеличение антибиотической активности при увеличении времени контакта с тест-объектами, что также отмечалось для многих исследованных антибиотиков. Также было обнаружено, что значения эффективных концентраций исследуемых лекарственных веществ-ингибиторов биолюминесценции тест-объектов (ЭК50), практически совпадают с известными значениями их минимальных ингибирующих концентраций (МИК), действующими на распространенные патогенные бактерии. Таким образом, было установлено, что лекарственные вещества растительного происхождения, которые обладают антибактериальной активностью, могут быть выявлены и проанализированы с использованием биолюминесцентных бактериальных биосенсоров. Применимость разработанных методов анализа на основе биолюминесцентных бактериальных биосенсоров была оценена при проведении скрининговых исследований антибактериального потенциала некоторых лекарственных растений Крыма. Было показано, что среди 12 исследуемых образцов, как минимум три (скумпия, солодка и орех), обладают значительным потенциалом антибиотической активности. Дополнительные исследования с применение рекомбинантных lux-биосенсоров подтвердили антибиотическую активность скумпии и позволили установить, что действие ее водных вытяжек может быть связано с окислительным стрессом.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Второй этап выполнения проекта (2023 г) был направлен на дальнейшее совершенствование методик биолюминесцентного анализа антибактериальной активности веществ растительного происхождения и экстрактов лекарственных растений. Установлена применимость неводных растворителей этилового спирта и диметилсульфоксида (ДМСО) для получения растворов биологически активных веществ (БАВ) и вытяжек из лекарственного растительного сырья. Показано, что добавление этих растворителей к биолюминесцентным тест-бактериям до 5% (V/V) не оказывает значительного влияния на результаты оценки антибактериальной активности. Преимуществом такого подхода является отсутствие дополнительных стадий пробоподготовки при проведении анализа, что было использовано в настоящем проекте при изучении антибактериального потенциала лекарственных растений Крыма. Продолжено изучение антибактериальной активности БАВ растительного происхождения и экстрактов лекарственных растений с использованием пяти рекомбинантных lux-биосенсоров c конститутивной и индуцибельной биолюминесценцией. Изучено действие водных и неводных растворов четырех БАВ (кверцетин, 8-гидроксихинолин, галловая кислота, тимохинон). Показано, что бактерии A. fischeri F1 обладают большей чувствительностью к действию тестируемых веществ, чем E. coli (pXen7-lux). Установлено, что действие нерастворимого в воде кверцетина в отношении природных и рекомбинантных тест-бактерий с конститутивной биолюминесценцией усиливается на 20% в неводных растворителях, по сравнению с водой. Это означает, что по крайней мере спирт и ДМСО, могут иметь ряд преимуществ при исследовании не растворимых в воде БАВ и при их экстракции из лекарственного растительного сырья (ЛРС). Изучение бактерицидной активности с использованием спот теста (Suppi S. et al., 2015) показало, что рост и биолюминесценция бактерий A. fischeri F1 полностью подавляется всеми исследуемыми БАВ при концентрациях от 0,02 мг/мл и выше. Аналогичное действие на тест-бактерии E. coli (pXen7) было выявлено только для тимохинона при концентрации более 0,2 мг/мл. Исследования потенциальных механизмов антибактериального действия четырех БАВ с применением lux-биосенсоров выявили индукцию биолюминесценции E. coli (pSoxS-lux). Также, для кверцетина наблюдалась незначительная активация свечения E. coli (pRecA-lux) и E. coli (pColD-lux). Тимохинон и галловая кислота в этих условиях вызывали индукцию биолюминесценции E. coli (pKatG-lux). Полученные данные свидетельствуют о том, что, не смотря на антиоксидантные свойства исследуемых БАВ (Porras G., et al., 2021), их антибактериальное действие может сопровождаться окислительным стрессом. Кроме этого, по крайней мере для кверцетина, антибактериальная активность может быть также связана с ДНК-тропностью и повреждением нуклеиновых кислот. Определенный интерес представляет сравнение результатов оценки антибактериальной активности БАВ, полученных с использованием биолюминесцентного анализа, с данными классических микробиологических методов на патогенных микроорганизмах. Анализ литературных данных показал, что все исследованные вещества ингибируют рост S. aureus (грамположительные) и E. coli (грамотрицательные), а также ряда других видов патогенных бактерий (Salehi B., et al., 2020; Carrillo-Garmendia A., et al, 2023; Cherdtrakulkiat R., et al, 2019; Borges A., 2013; Goel S., et al., 2018). Во всех случаях, значения ЭК50 веществ, которые ингибировали биолюминесценцию A. fischeri F1, были ниже, чем их МИК в отношении патогенных бактерий. Что касается бактерицидности, то для кверцетина, 8-гидроксихинолина и тимохинона, то оно установлено в отношении S. aureus, E. coli., P. aeruginosa с минимальными бактерицидными концентрациями (МБК) 12 ‒ 120 мкг/мл. В 2023 г были продолжены работы по изучению антибактериального потенциала лекарственных растений Крыма. Для проведения скрининговых исследований были использованы природные и рекомбинантные биолюминесцентные тест-бактерии, а также методики анализа, разработанные на предыдущих этапах выполнения проекта. Были изучены водные, спиртовые и ДМСО вытяжки из 20 лекарственных растений Крыма: 1) зопник крымский (Phlomis taurica), 2) чабрец (Thymus tauricus), 3) бессмертник (Helichrysi arenarii), 4) скумпия (Cotinus coggygria), 5) тысячелистник (Achillea millefolium), 6) железница крымская (Sideritis taurica), 7) чистотел (Chelidonium majus), 8) шалфей (Salvia nemorosa), 9) донник лекарственный (Melilotus officinalis),10) мать-и-мачеха (Tussilago farfara), 11) дурнишник (Xanthium strumarium), 12) полынь (Artemisia vulgaris), 13) лаванда (Lavandula angustifolia), 14) живокость (Delphinium peregrinum), 15) горицвет (Adonis vernalis), 16) примула (Primula veris), 17) мускари (Muscari latifolium), 18) мята (Folium menthae), 19) мелисса (Melissa officinalis), 20) чернушка посевная (Nigella sativa). Спектральные исследования (200-700 нм) показали, что экстракты исследуемых растений, полученные с применением различных растворителей, имеют сходный состав. Изучение антибактериальной активности вытяжек из ЛРС с использованием более чувствительного тест-штамма A. fischeri F1 выявлено полное ингибирование биолюминесценции водными экстрактами растений 3, 4, 6, 11, 13. Аналогичным действием обладали спиртовые экстракты 1, 4, 13, 18, 20. Экстракты, полученные с использованием ДМСО, практически все ингибировали биолюминесценцию A. fischeri F1, более чем на 80%. Максимальной активностью обладали ДМСО вытяжки из растений 1, 4, 6, 7, 11, 16, 20. Бактерицидное действие в отношении A. fischeri F1 было выявлено у водных и спиртовых экстрактов 3, 4, 6, 11, 13. Дополнительно к указанным вытяжкам, спиртовые и ДМСО экстракты 18, 20 также проявляли бактерицидное действие. Изучение возможных механизмов выявленного антибактериального действия с использованием четырех lux-биосенсоров показало, что водные вытяжки растений 3, 4, 6, 11, 13, 15, которые ингибировали биолюминесценцию A. fischeri F1 более чем на 80% и проявляли бактерицидные свойства в спот-тесте, активировали биолюминесценцию штамма E. coli (pKatG-lux), чувствительного к окислительному стрессу. Коэффициенты индукции варьировали от 2 до 9, что может свидетельствовать о наличие в указанных водных вытяжках БАВ, обладающих прооксидантным действием. В отчетный период продолжены работы по изучению антибактериальной активности гидролатов (АО «АЭМСЗ, Россия), следующих лекарственных растений Крыма: лаванда (Lavandula angusifolia), иссоп (Hyssоpus officinаlis), шалфей (Sаlvia officinаlis), розмарин (Rosmarinus officinalis), роза (Rosa damascеna × Rosa gallica). Методом ГЖХ было установлено, что их химический состав характерен для конкретного вида растений и в основном представлен компонентами эфирных масел. Показано, что все исследованные гидролаты обладают антибактериальной активностью как в отношении природных биолюминесцентных тест-бактерий A. fischeri F1, так и рекомбинантных бактерий E. coli (pXen7-lux). Из них бактерицидное действие выявлено только у гидролатов иссопа и лаванды, которые ингибировали рост тест-бактерий при разведении менее чем 1:5. Таким образом, в 2023 г были достигнуты все основные цели и задачи проекта. Закончена разработка методов анализа антибактериальной активности на основе биолюминесцентных бактериальных биосенсоров и показана их применимость для скрининговых исследований лекарственных веществ растительного происхождения и экстрактов лекарственных растений.