Аннотация результатов, полученных в 2022 году
За первый год выполнения проекта 22-25-00795 было выполнено электронномикроскопическое исследование образцов глиом и установлены ультраструктурные диагностические критерии глиальных опухолей головного мозга различной степени злокачественности (астроцитомы Грейд 2, Грейд 3, Грейд 4). Описаны и проиллюстрированы особенности формы клеток, ядер и их содержимого, морфологические особенности отростков и наполнение глиофибриллами, отмечены характеристики межклеточных контактов. Полученные данные могут быть использованы как дополнительный диагностический инструмент в нейроонкологической практике. На серийных и одиночных ультратонких срезах было показано, что в астроцитомах Грейд 2 щелевые контакты формируют сети, соединяя тонкие отростки опухолевых клеток. Отмечено, что в плеоморфной ксантоастроцитоме клетки напрямую соединяются протяженными нексусами, а щелевые контакты являются единственным инструментом межклеточного сообщения между опухолевыми ксантоастроцитами. Кроме того, щелевые контакты в опухолях формируют небольшие нексусы на соме и в непосредственной близости от нее. Это наблюдение поднимает вопрос о возможности сообщения отростков одной опухолевой клетки между собой. В глиобластоме Грейд 4 формируется наименьшее количество щелевых контактов среди всех просмотренных образцов, при этом нексусы содержат признаки перфораций. Наибольшее количество щелевых контактов нами было обнаружено в анапластических астроцитомах. Эти данные были подтверждены проведенной морфометрией. На общей площади 6700 мкм было обнаружено 299 щелевых контактов с неизмененными нексусами. Эти данные были подтверждены данными морфометрии на флюоресцентном уровне при помощи конфокального лазерного микроскопа. Методом электронной иммуногистохимии было показано, что наблюдаемые положительные флюоресцентные сигналы на ультраструктурном уровне представляют собой гомотипические коннексоны, составленные молекулами коннексина 43. Показано, что белок коннексин также сосредоточен в контактирующих отростках опухолевых клеток, обеспечивая доставку белка для встраивания в мембрану. Использование коллоидного золота в качестве метки позволило определить, что флюоресцентные метки, не связанные с образованием щелевых контактов как правило ассоциированы с мембранами. Это наблюдение может быть связано с образованием полуканалов или образованием щелевых контактов вне плоскости среза. Все обнаруженные в ходе выполнения проекта щелевые контакты астроцитом были образованы отростками, заполненными глиофибриллами и имеющими признаки малигнизации. Исследование сигналов коннексина 43 и сканирование 40 мкм срезов опухоли по оси Z также позволило выявить особенности локализации этого белка в опухолях. Плотность сигналов в астроцитомах соответствует плотности щелевых контактов с характерной ультраструктурой. При этом отмечено, что некоторые положительные сигналы в опухолях присутствуют дольше чем другие на срезах. Такие позитивные Сх43+ точки имели более крупные размеры и, при исследовании в объеме были связаны с опухолевыми клетками. Результаты работ были представлены в виде устных докладов на двух конференциях, вошли в материалы опубликованной монографии. Также в качестве показателей опубликованы две экспериментальные работы и одна обзорная. Ссылки на информационные ресурсы в сети интернет: https://donstu.ru/news/nauka/uchenye-dgtu-i-rostgmu-utochnyat-ustroystvo-opukholey-mozga-chtoby-razrabotat-novye-metody-ikh-leche/ , https://mel.fm/zhizn/razbor/5714368-chem-zanimayutsya-bioinzhenery-i-prichem-tut-kotlety-i-kollagen-meduz

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Задачей 2023 года Проекта являлось определение функционального состояния щелевых контактов в глиальных опухолях головного мозга, путем исследования ко-экспрессии коннексина и полиамина для определения роли этих белков в нейроонкогенезе. В ходе реализации проекта были использованы следующие методы исследования: конфокальная лазерная микроскопия, двойное и тройное иммунофлюоресцентное мечение с антителами к 1) коннексину 43/ГФАБ/sytox green 2) спермину/ГФАБ/sytox green 3) спермину/коннексину43/sytox green 4) ГФАБ/S100/sytox green. Далее на этих же срезах проводилась электронная иммуногистохимия для визуализации полиамина и коннексина на уровне ультраструктуры единичных клеток под электронным микроскопом. Также проводилась 3д реконструкция клеток и сигналов при помощи конфокальной лазерной микроскопии и анализ серийных ультратонких срезов. Основным материалом за 2023 год являлись образцы опухолей с диагнозом глиобластома. При анализе образцов было показано, что некоторые отростки опухоли имеют особое значение: длинные, без признаков ветвления, направленные, игловидные отростки, простирающие на большие расстояния в ткани опухоли. Отмечено, что именно эти отростки являются так называемыми «строительными лесами» опухоли и способны распространяться за ее края. Более того, такие отростки содержали четко визуализируемые яркие сигналы коннексина 43, предположительно - запирающий механизм опухоли при ее инвазии в окружающие нейронные сети неизмененной ткани. Исследования локализации другого белка глии, s100, позволило выявить его гетерогенность по сравнению с белком ГФАБ в опухоли благодаря высокой визуализации: ГФАБ локализован в цитоплазме и крупных отростках опухоли, при этом белок s100 не гомогенен, имеет вид опушающих конгломератов, локализованных в более мелких отростках и присутствует там, где ГФАБ отрицательный. Во всех исследованных образцах глиальных опухолей головного мозга, в том числе и при 3Д построении всего среза и отдельных клеток наблюдались положительные сигналы Cx43 в виде точек разного размера, расположенных на отростках клеток, ассоциированных как с ГФАБ, так и с S100. В глиобластомах Сх43+ сигналы плотно локализованы вокруг микрокапилляров опухоли и в некоторых случаях сигналы Cx43 наблюдались в виде узких линий, связанных с телами клеток. В целом, анализ сигналов Cx43+ указывает на гетерогенный размер Cx43: в бОльшем количестве скопления разнообразно ветвящихся отростков, наблюдается более развитая сеть Сх43 сигналов, более того, они располагаются на отростках, что, предположительно, связано с формированием щелевых контактов. Морфометрическое исследование Сх43 сигналов в нейропиле показало, что срез, площадью 125/125 мкм2 и толщиной 10 400 мкм содержит 417 положительных сигналов. Следующим шагом отчетного периода был анализ локализации полиамина спермина и его ко-локализации с коннексином 43. Прежде всего, было показано, что на срезах опухолей отмечены как области положительной реакции, так и резко отрицательной, что нуждается в дополнительных исследованиях и демонстрирует возможность спермина выступать диагностическим маркером глиальных опухолей. Также эти данные свидетельствуют об исключительной роли полиаминов в головном мозге, в том числе для процесса опухолевой трансформации. Электронная иммуногистохимия показала, что полиамин в основном накапливается в цитоплазме клеток глиобластомы, расположенных среди сети глиальных нитей и остатков миелинизированных волокон аксонов нейронов. Кроме того, полиамин-содержащие клеточные отростки образовывали щелевые контакты. Эти взаимодействия подтвердило проведенное нами исследование ко-экспрессии полиамина и Cх43. Наложение двух сигналов показало совместную ко-локализацию в одних и тех же областях: мембранах отдельных клеток и отдельных точках на отростках опухолевой ткани. Обнаружение сетей щелевых соединений и сверхэкспрессии спермина в одних и тех же областях глиобластом позволяет предположить, что клетки глиомы могут быть способны интегрироваться в окружающие нейронные сети головного мозга, потенциально служа механизмом высвобождения различных продуктов, например, продуктов гликолиза. Реализация этих функций в синцитии осуществляется за счет открытия щелевых контактов, чему способствует спермин. Исследование щелевых контактов на серийных ультратонких срезах показало, что одна опухолевая клетка по глубине 250 нм формирует как минимум 4 щелевых контакта между собственными отростками. При сопоставлении с данными конфокальной микроскопии, следует сделать вывод о возможности формирования клетками глиобластом как щелевых контактов, так и полуканалов (ультраструктура которых не определима под электронным микроскопом, однако, идентифицируемых при помощи антител к коннексину 43). При этом, функции обоих структур различны, что следует принимать во внимание при разработке препаратов воздействия или управления открытым или закрытым состоянием щелевых контактов и полуканалов. Одним из таких вероятных методов воздействия является использования молекул полиаминов - многофункциональных молекул, содержащих несколько аминогрупп и участвующих в процессах клампирования астроцитов и деполяризации синцития, в том числе опухолевого синцития, объединенного щелевыми контактами. За 2023 год реализации проекта результаты были представлены на двух конференциях всероссийского и мирового уровня: 1) «Актуальные вопросы экспериментальной онкологии», ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России, 2) ISOTT 2023 The International Society on Oxygen Transport to Tissue, Токио, Япония. Итоговые результаты проекта были оформлены в рукопись «Analysis Of Cx43 And Spermin Localization In Glioblastomas As A Releasing Anti-Glycolytic Mechanism» и отправлены в журнал «Advances in Experimental Medicine and Biology» издательства Springer, Nature.