Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (МСК) обладают выраженным трофическим и иммуномодуляторным потенциалом, что позволяет их рассматривать как перспективный клеточнотерапевтический инструмент для регенеративной медицины. Для улучшения качества клеточного продукта предлагается проводить предварительную инкубацию МСК в гипоксических условиях, что должно способствовать стимуляции регенеративного потенциала. В клеточном ответе на гипоксию помимо такого ключевого фактора, как HIF-1, задействован также целый ряд регуляторных кислород-чувствительных молекул, осуществляющих эпигенетический контроль за функциями клетки. Выявление закономерностей функционирования этих регуляторов является важной задачей на пути решения вопроса направленной модификации свойств МСК. Задачи данного исследования: -выявление взаимосвязи путей контроля транскрипционной активности МСК, зависимых от уровня О2, в частности, регуляция через JmjC-доменсодержащие деметилазы гистонов и транскрипционный фактор HIF-1; -определение роли деметилаз гистонов в модификации свойств МСК, связанных с реализацией регенеративного потенциала, в гипоксических условиях. В 2022 г проводили эксперименты на МСК из пупочного канатика человека. МСК любезно предоставлены д.б.н. Романовым Ю.А. (ООО «Криоцентр»). В ходе экспериментов оценивали эффекты острого (1 ч) и более длительного (24 ч) гипоксического стимула (1% О2). Для того, чтобы выделить эффекты HIF-1, осуществляли ингибирование мРНК HIF1A методом РНК-интерференции. При анализе влияния гипоксии на экспрессию генов, кодирующих белки-регуляторы метилирования гистнонов, и роль HIF-1 в этом процессе методом количественной ПЦР показано, что транскрипционная активность KDM3A и KDM4A зависит от длительности гипоксического воздействия. В первый час наблюдается тенденция к снижению экспрессии в контрольных МСК и, наоборот – повышению – в МСК, обработанных ингибитором HIF1A, после 24 ч гипоксии картина меняется на противоположную. Гипоксическое воздействие (1 ч и 24 ч) способствует повышению экспрессии EHMT2 с участием HIF1A: нокдаун HIF1A нивелирует данный эффект. Данные, полученные в ходе вестерн-блот анализа, свидетельствуют о снижении количества лизиновой деметилазы гистонов KDM4A и лизиновой метилтрансферазы гистонов G9a в условиях длительного (24 ч) воздействия гипоксии. Кроме того, этот эффект усугублялся при ингибировании HIF1A. При этом гипоксия и ингибирование HIF1A сами по себе приводили к снижению количества диметилированного Н3K9, а совместное действие этих факторов наоборот приводило к повышению уровня Н3K9me2. Методом иммунопреципитации с последующей количественной ПЦР показано, что диметилирование Н3К9 в промоторных областях исследованных генов осуществляется, по крайней мере, частично с участием HIF-1-опосредованного механизма. Для ряда генов (KDM3A, IDO1, FGF2) наблюдалось повышение уровня диметилирования Н3К9 под действием гипоксической инкубации, и данный эффект ослаблялся и нивелировался ингибированием HIF1A. Диметилирование Н3К9 не оказывало регуляторного воздействия на промоторные области некоторых генов (IL10, CCL2). Для части генов гипоксия способствовала снижению диметилирования Н3К9 промоторных областей (ANGPT, VEGFA), по-видимому, также с участием HIF1A. Для некоторых генов не прослеживалось строгой взаимосвязи уровня О2 в среде культивирования и HIF1-зависимой регуляции: на фоне повышения (CSF2, IGF1) или отсутствия изменения (TGFB1) диметилирования Н3К9 в промоторных областях генов при гипоксической инкубации ингибирование HIF1A способствовало увеличению уровня H3K9me2. Напротив, при отсутствии гипоксической регуляции диметилирования Н3К9 в промоторной области CCL2, ингибирование HIF1A вызывало снижение уровня H3K9me2. С помощью количественной ПЦР была оценена экспрессия генов, участвующих в ответе на гипоксию (NFKB1), регулирующих ангиогенез (ANGPT1, VEGFA), иммуномодуляторных (IDO1, IL10), обеспечивающих трофическое действие (CCL2, IGF1, FGF2, CSF2, TGFB1). Выявлено повышение экспрессии NFKB1 под действием гипоксии, при этом в острый период происходит, по-видимому, HIF-1-зависимое ингибирование NFKB1, а в более поздние сроки HIF1A может способствовать повышению экспрессии. Изменения транскрипционной активности NFKB1 происходили параллельно KDM4A, хотя, отличались в направленности ответа на ингибирование HIF1A с последующим коротким гипоксическим экспонированием. Гипоксия осуществляла отрицательную регуляцию транскрипционной активности ANGPT, при этом нокдаун HIF1А также способствовал снижению уровня мРНК ANGPT1. 24 ч гипоксическое культивирование приводило к повышению экспрессии VEGF, и по крайней мере, отчасти этот эффект опосредован HIF1A. CCL2 отвечал на 1 ч и 24 ч гипоксию снижением экспрессии, а результат ингибирования HIF1A зависел от длительности последующего гипоксического стимула. Транскрипционный ответ FGF2 на гипоксию и ингибирование HIF1A также зависел от длительности инкубации. Гипоксия HIF-1-зависимо стимулировала экспрессию TGFB1, что особенно выражено после 24 ч экспозиции. Для большинства рассмотренных генов справедливо, что транскрипционный ответ на гипоксический стимул зависел от его длительности, и направленность изменения экспрессии после воздействия ингибитором HIF1А также менялась в динамике гипоксического культивирования. Методами мультиплексного анализа (MagPix) и иммуноферментного анализа показано, что гипоксия приводила к увеличению продукции цитокинов: IL-1RA, VEGF, снижению уровня: IP-10, MCP-1, MCP-3, PDGF-AA, IL4, IL-8, G-CSF, RANTES, Eotaxin и GRO. Ингибирование HIF1A с помощью siRNA в условиях стандартной концентрации О2 не влияло на паракринную активность МСК. А при гипоксии происходило увеличение содержания IL-1RA, VEGF, снижение концентрации IP-10, MCP-1, IL-4, MCP-3, PDGF-AA, IL-8, G-CSF, GRO. При ингибировании HIF1A для ряда цитокинов модулировалась выраженность паракринного ответа: нокаут HIF1A провоцировал снижение гипоксия-индуцированной продукции IL-8 и повышение уровня G-CSF. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о значимости кислород-зависимой регуляции функционирования ферментов, участвующих в эпигенетическом контроле функций через метилирование/деметилирование Н3К9, и существенной роли HIF-1alfa в этих процессах. Данные механизмы реализуются при регуляции функций МСК, связанных с регенеративным потенциалом, в том числе, продукции паракринных медиаторов

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (МСК) представляются перспективным инструментом клеточной терапии в регенеративной медицине за счёт наличия выраженных трофических и иммуномодуляторных свойств. Получение более оптимального по качеству и регенеративному потенциалу клеточного продукта предлагается осуществлять при помощи инкубации МСК в гипоксических условиях. В таких условиях происходит активация различных кислород-чувствительных молекул, реализующих контроль за функциями МСК, среди которых такой ключевой фактор, как HIF-1, а также ряд ферментов, осуществляющих модификации гистонов и таким образом ответственных за эпигенетическую регуляцию МСК. Установление закономерностей функционирования и взаимосвязи этих регуляторных молекул является важной задачей на пути решения вопроса направленной модификации свойств МСК. На этапе 2023 г были проведены эксперименты, направленные на выявление роли кислород-зависимых деметилаз гистонов в регуляции ответа МСК на гипоксию. Задачи данного этапа исследования: -определение роли JmjC-доменсодержащих деметилаз гистонов в регуляции МСК при гипоксии в контексте связи этого механизма с транскрипционным фактором HIF-1; -оценка участия деметилаз гистонов в модификации свойств МСК, связанных с реализацией регенеративного потенциала, в гипоксических условиях. В 2023 г проводили эксперименты на МСК из пупочного канатика человека. МСК любезно предоставлены д.б.н. Романовым Ю.А. (ООО «Криоцентр»). В ходе экспериментов выявляли эффекты лизиндеметилаз гистонов, для этого использовали ингибитор NSC636819 (Merck, Германия). Участие лизиндеметилаз гистонов в регуляции функций МСК в условиях гипоксии оценивали после обработки МСК ингибитором лизиндеметилаз и последующей 24 ч инкубации в гипоксической камере (1% О2). Цитофлуориметрический анализ показал, что обработка МСК из пупочного канатика ингибитором лизиндеметилаз гистонов NSC636819 не оказывала цитотоксического эффекта на клетки. Микроскопическое исследование не выявило изменения морфологии клеток. Вместе с тем, данные проточной цитометрии и вестерн-блот анализа указывают на то, что в условиях ингибирования лизиндеметилаз происходила регуляция уровня метилирования гистонов, и наблюдалось повышение количества H3K9me2 в МСК. По данным количественной ПЦР ингибирование лизиндеметилаз гистонов мало влияло на транскрипцию генов, кодирующих сами деметилазы (KDM3A, KDM4A), а также метилтрансферазу EHMT2, т.е. не наблюдалось ауторегуляции процессов метилирования гистонов на транскрипционном уровне. При этом результаты цитофлуориметрии указывают на то, что на уровне белков происходило повышение количества регуляторов метилирования гистона Н3К9: KDM3A, KDM4A и G9a, которое на фоне ингибирования активности лизиндеметилаз могло нести компенсаторную функцию. Вместе с этим повышался уровень HIF-1alpha, хотя, количество мРНК наоборот снижалось, т.е. помимо непосредственной регуляции транскрипции HIF1A через метилирование промотора либо кодирующих областей данного гена возможен также непрямой механизм через влияние на некоторые промежуточные звенья, в результате которого на фоне повышения уровня метилирования гистона Н3К9 происходит увеличение уровня белка HIF-1alpha, что могло реализовываться как за счёт более активной трансляции, так и за счёт снижения деградации данного белка. При ингибировании деметилаз гистонов с повышением уровня диметилирования Н3К9 (H3K9me2) в МСК из пупочного канатика создавались условия, при которых увеличивалось количество HIF-1alpha при нормоксии, тогда как гипоксические условия сами по себе оказывали регуляторное воздействие в той же степени, при этом ингибирование деметилаз гистонов в гипоксии не вызывало дополнительного стимулирующего эффекта, что также относится и к уровню деметилаз KDM3A, KDM4A и метилтрансферазы G9a. Несмотря на выявленную по данным количественной ПЦР стимуляцию транскрипционной активности генов отдельных цитокинов и хемокинов в МСК под действием ингибитора деметилаз гистонов, в частности, генов IL4, IL6, CXCL10, для ряда генов, в т.ч. IL8, CCL7 и CXCL10, наблюдалось снижение экспрессии, и по результатам ИФА и мультиплексного анализа (MagPix) общая тенденция сводилась к уменьшению продукции в кондиционированную среду цитокинов, хемокинов и факторов роста: IL-1a, IL-1b, IL-8, IL22, IL-27, GROa, MCP-1, RANTES, G-CSF, GM-CSF, PDGF-AA, PDGF-AB/BB, EGF, FGF-1, sCD40L, TNFa и TNFb. Регуляция выработки некоторых из этих цитокинов при ингибировании деметилаз гистонов зависела также от уровня оксигенации, а именно: IL-2, IL-8, IL-9, GROa, RANTES, PDGF-AA. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о функционировании эпигенетического механизма регуляции HIF-1alpha, в котором задействованы ферментные системы, контролирующие уровень метилирования гистонов, в т.ч. Н3К9, и существенной роли в этих процессах лизиндеметилаз гистонов. Данный механизм является ингибитором паракринной активности МСК, и по-видимому, в условиях гипоксии его действие ограничивается и дополняется некоторыми другими регуляторными путями, в результате чего происходит комплексное и разнонаправленное изменение продукции растворимых медиаторов.